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Quelle est l'étendue de CD47 ?

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Le CD47, alias le signal « ne me mangez pas », a récemment été revendiqué comme étant exprimé sur toutes les cellules tumorales. Cela ne semble pas corroborer avec d'autres expériences de biologie cellulaire. Sur quelles autres cellules CD47 est-il exprimé ?


Je ne sais pas à quel point. Exécutons une simple requête de données et découvrons : Accédez à GEO au NCBI. Dans la fenêtre "Profils de gènes", tapez CD47 et appuyez sur Entrée pour lancer la requête. En haut de la page résultante, utilisez le lien intitulé « Limites » pour restreindre les 7000+ résultats à l'homme en entrant le terme « humain » dans la fenêtre « Organisme DataSet ». Il y a donc plus de 3700 résultats. Parcourez-les pour avoir une idée des types de cellules et dans quelles conditions CD47 est exprimé.

Essayons une deuxième méthode. Accédez au portail BioGPS. Entrez CD47 dans la fenêtre appropriée et exécutez la requête. Dans les résultats, sélectionnez la ligne avec l'ID # 961 car cela représente le gène humain CD47. Le graphique d'expression/activité génique résultant pour Hs (humain) vous montrera en termes plus généraux où CD47 est exprimé.


Je ne peux pas donner de réponse complète à cela, mais les protéines CD se trouvent sur les globules blancs de divers types. Si vous y pensez, il est impossible qu'une protéine de surface puisse être seul observé sur les cellules cancéreuses car le cancer est une lignée cellulaire qui est une impasse reproductive. Vous pouvez voir sur la boîte de généalogie en bas à droite de la page - son gène est exprimé, au moins en petite quantité, sur presque tous les principaux types de tissus.


Résumé

Les macrophages reconnaissent CD47 comme marqueur de “self” et phagocytent les cellules hématopoïétiques nulles CD47. En utilisant des modèles de chimères CD47, nous montrons ici que l'activité phagocytaire des macrophages contre les cellules hématopoïétiques nulles CD47 est conférée par l'expression de CD47 sur des cellules non hématopoïétiques, et ce processus d'éducation est indépendant des cellules hématopoïétiques. Les macrophages dans les chimères où les cellules non hématopoïétiques expriment CD47 phagocytent les cellules nulles CD47, tandis que ceux des chimères dépourvues de CD47 sur les cellules non hématopoïétiques sont tolérants aux cellules nulles CD47. Cependant, les macrophages de ces dernières chimères conservent une activité phagocytaire contre les globules rouges nuls CD47, démontrant une tolérance des macrophages fractionnés aux cellules hématopoïétiques nulles CD47. Les résultats mettent en évidence l'importance potentielle des cellules non hématopoïétiques dans la régulation de la fonction des macrophages et suggèrent un mécanisme de tolérance aux macrophages non caractérisé auparavant.

Les macrophages sont essentiels aux réponses immunitaires innées et adaptatives. Ils initient la réponse immunitaire innée en reconnaissant les agents pathogènes au moyen d'une gamme de récepteurs ayant une spécificité pour les molécules de reconnaissance de formes (1, 2). Les macrophages expriment également des récepteurs inhibiteurs qui contrôlent l'activité des macrophages dans les tissus (3). L'un de ces récepteurs appelé protéine régulatrice de signalisation (SIRP)α (également connu sous le nom de CD172a, SHPS-1) est exprimé sur les macrophages et les cellules dendritiques (CD), qui reconnaît CD47, une glycoprotéine membranaire pentaspan exprimée de manière ubiquitaire dans tous les tissus (4 𠄶). Des études antérieures ont montré que CD47 est un marqueur essentiel de “self,” et sa signalisation via SIRPα empêche une auto-phagocytose inappropriée (7). Les cellules hématopoïétiques n'exprimant pas CD47 sont rapidement éliminées de la circulation sanguine par les macrophages et les CD (7, 8) [informations à l'appui (SI) Fig. 6]. Étant donné que seules les cellules CD47 KO sont éliminées chez les souris WT recevant un mélange de cellules CD47 KO et WT, l'expression de CD47 sur une cellule individuelle, mais pas sur les macrophages ou d'autres cellules environnantes, est requise pour l'inhibition de la phagocytose, et une telle protection est probablement médiée par une interaction directe entre CD47 sur une cellule cible et SIRPα sur les macrophages (SI Fig. 7).

Fait intéressant, les macrophages et les CD de souris CD47 KO ne phagocytent pas les cellules CD47 KO. Étant donné que le niveau d'expression de SIRPα sur les macrophages CD47 KO est pratiquement le même que celui des macrophages WT, cette tolérance aux cellules CD47 KO est peu probable induite au niveau de l'expression de SIRPα (7). Il est possible que le manque d'expression de CD47 sur les macrophages ou dans l'environnement puisse réguler la fonction des macrophages. Alternativement, une telle tolérance pourrait être acquise au cours du stade précoce du développement prénatal en compensation du gène perturbé, et peut ne pas se produire dans les macrophages normaux. De plus, on ne sait toujours pas pourquoi CD47, mais pas les ligands d'autres récepteurs inhibiteurs, est utilisé par les macrophages pour s'identifier chez les souris WT. Pour répondre à ces questions et comprendre les mécanismes de tolérance aux macrophages, nous avons évalué ici l'activité phagocytaire contre les cellules CD47 KO de macrophages à partir de divers types de chimères CD47, dans lesquelles CD47 est exprimé sur des cellules hématopoïétiques, des cellules non hématopoïétiques ou sur des cellules de les deux compartiments.


INTRODUCTION

L'extension des axones des neurones à leurs cellules cibles au cours du développement du système nerveux est guidée par une variété d'indices environnementaux, qui comprennent des chimioattractants et des chimiorépulsifs diffusibles, des protéines de la matrice extracellulaire et des molécules d'adhésion cellulaire (Tessier-Lavigne et Goodman, 1996 Dickson, 2002). En réponse à ces signaux de guidage, le cône de croissance de l'axone produit et rétracte des filopodes et des lamellipodes, processus qui nécessitent la régulation temporelle et spatiale du cytosquelette d'actine. Les membres de la famille Rho des petites protéines G, y compris Rho, Rac et Cdc42, sont impliqués en tant que médiateurs clés qui relient les signaux de guidage au réarrangement du cytosquelette d'actine (Ridley et al., 1992 Nobes et Hall, 1995 Kozma et al., 1997 Luo et al., 1997 Hirose et al., 1998 Takaï et al., 2001 Arakawa et al., 2003). Bien que Rac et Cdc42 favorisent l'extension des neurites, Rho l'inhibe ou induit l'effondrement du cône de croissance. Ces protéines sont également impliquées dans le développement dendritique (Threadgill et al., 1997). Bien que certains facteurs d'orientation, y compris la fente, la sémaphorine et l'éphrine, se soient avérés réguler les protéines de la famille Rho (Wahl et al., 2000 Whitford et Ghosh, 2001 Wong et al., 2001), on ne sait toujours pas comment d'autres signaux extracellulaires contrôlent l'extension des neurites à travers ces petites protéines G.

CD47, également connu sous le nom de protéine associée à l'intégrine (IAP), a été identifié à l'origine en association avec l'intégrine αvβ3 (Brown et al., 1990). C'est un membre de la superfamille des immunoglobulines (Ig), possédant une région extracellulaire de type Ig-V, cinq domaines transmembranaires putatifs et une courte queue cytoplasmique (Brown et Frazier, 2001). CD47 est impliqué dans la régulation de plusieurs processus cellulaires, y compris la migration des neutrophiles (Cooper et al., 1995 Parkos et al., 1996), activation des lymphocytes T (Reinhold et al., 1997 Waclavicek et al., 1997), l'apoptose des lymphocytes T et B (Mateo et al., 1999 Pettersen et al., 1999), et l'activation plaquettaire (Chung et al.,1997, 1999). La région extracellulaire de CD47 est responsable de son association avec la sous-unité de l'intégrine β3 (Lindberg et al., 1996b). Bien que la plupart des réponses cellulaires médiées par CD47 impliquent probablement l'activation d'intégrines, en particulier celle de vβ3 ou αIIbβ3 (Brown et Frazier, 2001), le mécanisme moléculaire d'une telle activation n'est pas entièrement compris. La région extracellulaire de CD47 lie également les ligands putatifs thrombospondine-1 (TSP1 Gao et al., 1996 Chung et al., 1997 Brown et Frazier, 2001) et SHP substrat-1 (SHPS-1 Jiang et al., 1999 Seiffert et al., 1999).

SHPS-1, également connu sous le nom de BIT ou SIRPα, est une protéine transmembranaire de type récepteur qui contient trois domaines de type Ig dans sa région extracellulaire ainsi que des sites putatifs de phosphorylation de la tyrosine et des sites de liaison pour les domaines SH2 de la protéine tyrosine phosphatases, SHP -2 et SHP-1, dans sa région cytoplasmique (Fujioka et al., 1996 Ohnishi et al., 1996 Kharitonenkov et al., 1997). Par sa formation d'un complexe avec SHP-2, SHPS-1 favorise la migration cellulaire en régulant la réorganisation du cytosquelette d'actine (Inagaki et al., 2000). Nous et d'autres avons récemment montré que CD47 et SHPS-1 constituent un système de communication cellule-cellule (le système CD47-SHPS-1) qui joue un rôle important dans une variété de fonctions cellulaires. L'engagement de SHPS-1 par CD47 inhibe la formation du complexe SHPS-1-SHP-2 et contribue ainsi à l'inhibition de la migration cellulaire par contact cellule-cellule (Motegi et al., 2003). La liaison de CD47 sur les globules rouges à SHPS-1 sur les macrophages inhibe également la phagocytose des globules rouges par les macrophages, un processus qui nécessite l'interaction de SHP-1 avec SHPS-1 (Oldenborg et al.,2000, 2001). Les anticorps monoclonaux anti-CD47 inhibent la transmigration des neutrophiles (Liu et al., 2001), suggérant que le système CD47-SHPS-1 pourrait médier la régulation inhibitrice bidirectionnelle de la migration cellulaire. La voie de signalisation activée par la liaison de SHPS-1 à CD47 reste cependant largement inconnue. En revanche, certaines réponses cellulaires déclenchées par la liaison de TSP1 à CD47 semblent être médiées par la protéine G hétérotrimérique sensible à la toxine pertussis (PTX) Gje (Frazier et al., 1999 Brown et Frazier, 2001).

Dans le SNC, CD47 et SHPS-1 sont localisés dans des régions riches en synapses telles que l'hippocampe et le cervelet (Jiang et al., 1999 H. Ohnishi et T. Matozaki, observation non publiée). Dans la rétine, les deux molécules sont localisées sur des sites présynaptiques ou postsynaptiques (ou les deux), cependant, SHPS-1 ne parvient pas à s'associer aux sites synaptiques chez les souris knock-out CD47, suggérant que l'interaction de SHPS-1 avec CD47 est nécessaire pour sa localisation synaptique ( Mi et al., 2000). De plus, l'abondance de CD47 dans l'hippocampe a été associée à la rétention de mémoire chez le rat (Huang et al., 1998), et la potentialisation à long terme (LTP) est altérée chez les souris knock-out CD47 (Chang et al., 1999), suggérant un rôle pour CD47 dans la plasticité synaptique et la formation de la mémoire dans l'hippocampe. Ensemble, ces observations suggèrent que, grâce à son interaction avec SHPS-1, CD47 pourrait médier la communication neuronale cellule-cellule de manière bidirectionnelle et moduler ainsi la transmission synaptique. Quatre isoformes épissées alternativement d'ARNm de CD47 de souris ont été identifiées, dont l'une, désignée forme 4, est la plus abondante dans le cerveau (Reinhold et al., 1995).

Malgré ces diverses observations, cependant, les fonctions physiologiques du CD47 dans les cellules neuronales et le mode d'action de cette protéine restent en grande partie inconnus. Nous avons maintenant examiné le rôle de CD47 dans la régulation du remodelage des neurites dans les cellules de neuroblastome N1E-115.


CD47/SIRPα, UN POINT DE CONTRLE IMMUNITAIRE POUR LE SYSTÈME IMMUNITAIRE

Parmi les cellules de la lignée myéloïde, le macrophage a un potentiel important en tant que médiateur de thérapies anticancéreuses en raison de sa capacité de phagocytose robuste [ 8, 9]. CD47, connue sous le nom de protéine associée à l'intégrine, a d'abord été identifiée comme une protéine transmembranaire des globules rouges (RBC) [ 10]. La protéine régulatrice du signal alpha (SIRPα), une protéine transmembranaire sur les macrophages, est le principal récepteur du CD47 [ 11]. La liaison de CD47 à SIRPα déclenche le couplage de SIRPα à ces phosphatases, délivrant ainsi les signaux « ne me mange pas » aux macrophages, empêchant ainsi leur activation [ 8, 12, 13]. L'expression de CD47 est considérée comme un mécanisme d'autoprotection des cellules normales, y compris les globules rouges transfusés, les lymphocytes et les plaquettes, pour résister à l'élimination de la phagocytose des macrophages [14]. Il est bien documenté que les cellules souches hématopoïétiques cinétiques (CSH) se protègent de la phagocytose des macrophages en régulant positivement l'expression de CD47 lors de leur passage à travers les sinusoïdes, puis elles diminuent l'expression de CD47 après avoir déménagé dans la moelle [15]. De plus, le niveau d'expression de CD47 prédit la probabilité que les CSH puissent être phagocytées par les macrophages pendant la circulation [16]. Alors que l'absence d'interaction CD47-SIRPα pourrait activer les récepteurs prophagocytaires pour déclencher la phagocytose des macrophages des globules rouges [ 17].

Cibler l'axe CD47/SIRPα pour le traitement du cancer. L'Acm anti-CD47, l'Acm anti-SIRPα et la protéine de fusion SIRPα-Fc améliorent la phagocytose tumorale par les macrophages, permettant la présentation d'antigènes tumoraux aux cellules T. TCR, récepteur des cellules T. CMH, complexe majeur d'histocompatibilité.

Cibler l'axe CD47/SIRPα pour le traitement du cancer. L'Acm anti-CD47, l'Acm anti-SIRPα et la protéine de fusion SIRPα-Fc améliorent la phagocytose tumorale par les macrophages, permettant la présentation d'antigènes tumoraux aux cellules T. TCR, récepteur des cellules T. CMH, complexe majeur d'histocompatibilité.

Dans le processus de cancérogenèse, une surexpression de CD47 a été identifiée dans la plupart des tumeurs (Fig. 1). Dans le cancer hématologique, l'expression de CD47 sur la leucémie aiguë myéloïde/lymphoblastique, les cellules de lymphome non hodgkinien et la moelle osseuse d'échantillons de myélome multiple a été détectée avec une augmentation de plusieurs fois par rapport aux tissus normaux et le niveau de CD47 était prédictif de la survie globale au traitement primaire [16, 18]. En outre, des études ont également montré que les tumeurs solides, y compris le sein, l'ovaire, la vessie, le côlon, le glioblastome, la tumeur de la prostate et le carcinome hépatocellulaire, exprimaient environ trois à cinq fois plus de CD47 que les tissus normaux correspondants [19]. Lorsque les patients ont été répartis dans les groupes « CD47 bas » et « CD47 élevé » sur la base d'une analyse univariée, il a été démontré qu'un niveau élevé d'expression de l'ARNm de CD47 était associé à une diminution de la survie sans progression et de la survie globale [19]. Par conséquent, ces preuves indiquaient que l'axe CD47/SIRPα était exploité par les cellules malignes pour transmettre le signal « ne me mangez pas » pour échapper à la surveillance des macrophages et à la phagocytose, ce qui a mis en évidence que le blocage de l'axe CD47/SIRPα pourrait être utilisé pour promouvoir la capacité des macrophages à phagocyter et éliminer les cellules tumorales.


3. Mécanismes sous-jacents au lymphome à cellules B réfractaire au blocage du point de contrôle immunitaire

La résistance à la thérapie par blocage des points de contrôle immunitaire dans les cancers humains a été largement examinée par Bellone M et Elia A [295], cependant, les mécanismes sous-jacents à la réfractaire du lymphome à cellules B au blocage des points de contrôle immunitaire sont encore mal compris.

Bien que des progrès majeurs aient été réalisés au cours des 20 dernières années pour surmonter la réfractaire des patients B-NHL aux thérapies standard grâce à l'introduction de blocages des points de contrôle immunitaires dans le cadre clinique, soit en tant qu'agents uniques, soit en thérapies combinées (tableau 1 et figure 2) , plusieurs paramètres peuvent nuire à l'efficacité de ces nouvelles approches. Des facteurs intrinsèques au patient tels que l'âge, le sexe, l'hétérozygotie HLA ou la perte de 㬢-microglobuline (B2M), l'amplification des voies de signalisation oncogènes, les cellules et molécules immunosuppressives présentes dans la TME peuvent altérer la reconnaissance des antigènes et contribuer à l'échec du point de contrôle immunitaire blocus [296,297] ( Figure 3 ).

Mécanismes de résistance au blocage des points de contrôle immunitaires. La dérégulation des composants du CMH de classe I tels que la perte de la microglobuline 㬢 (B2M) et la perte de l'hétérozygotie de l'antigène leucocytaire humain (HLA) ainsi que des défauts dans les voies de signalisation de l'IFN peuvent altérer la reconnaissance de l'antigène par les cellules T CD8+ antitumorales. L'amplification des voies de signalisation oncogènes telles que PI3K/AKT/mTOR, Wnt/β-caténine et MAPK augmente la production de cytokines immunosuppressives, déclenche l'exclusion des lymphocytes T de la TME et peut également entraîner une résistance au blocage des points de contrôle immunitaire. Les altérations épigénétiques (acétylation des histones ou méthylation de l'ADN) et génétiques (mutations délétères) sont des déclencheurs cruciaux des troubles de l'expression génique liés à l'épuisement prolongé des lymphocytes T qui pourraient éventuellement entraîner l'échec de la thérapie de point de contrôle immunitaire. De plus, les cellules suppressives dérivées des myéloïdes (MDSC), les Tregs, les macrophages associés aux tumeurs (TAM) et les fibroblastes associés au cancer (CAF) sont les principaux types de cellules immunosuppressives au sein de la TME qui peuvent contribuer à la résistance au blocage des points de contrôle immunitaire. Les molécules immunosuppressives telles que le TGF-β et l'IFN-γ, sécrétées par les cellules tumorales, les cellules myéloïdes et les macrophages dans le TME, peuvent également supprimer les fonctions des cellules T effectrices, rendant le blocage des points de contrôle immunitaire inefficace.

L'expression aberrante fréquente de PD-L1 que l'on trouve chez les patients atteints de lymphome entraîne le type de cancer le plus sensible à la thérapie anti-PD1. Cependant, le blocage de PD-1/PD-L1 peut être fortement influencé par des facteurs spécifiques à la maladie, et sa valeur prédictive dans les essais cliniques est encore controversée. Les données incohérentes pourraient être principalement attribuables aux ressources variables de PD-L1 (cellules tumorales, cellules du microenvironnement tumoral, sang périphérique), aux différences dans les procédures de coloration (y compris la détection des anticorps) et aux seuils PD-L1 positifs/négatifs. De plus, il a été montré que PD-L1 peut interagir en cis avec CD80 sur les APC puis perturber la liaison entre PD-1 et PD-L1 [298]. Les effets fonctionnels des partenaires de liaison alternatifs mettent également en évidence les différences observées dans l'efficacité de l'immunothérapie PD-1/PD-L1 dans différents contextes biologiques.

Il existe plusieurs mécanismes déterminant si un patient répondra ou non à un blocage PD-1/PD-L1. Les tumeurs faiblement immunogènes peuvent avoir une population de lymphocytes T insuffisamment active pour répondre au blocage de PD-1/PD-L1 de plus, les tumeurs potentiellement immunogènes seront également résistantes au blocage de PD-1/PD-L1 si elles développent des mécanismes pour supprimer l'activation et infiltration de lymphocytes T après le traitement. De plus, les patients peuvent devenir résistants à la thérapie PD-1/PD-L1 s'ils ont une revitalisation insuffisante des cellules T CD8+ spécifiques de la tumeur épuisées ou s'ils ont perdu des antigènes cibles ou la capacité de les présenter. Enfin, certains patients pourraient initialement répondre au blocage de PD-1/PD-L1 mais devenir résistants si les lymphocytes T antitumoraux sont de courte durée [299].

Il existe également des mécanismes épigénétiques des cellules de lymphome B entraînant la résistance aux blocages des points de contrôle immunitaires. Les données in vitro et in vivo de Zheng et al. [300] ont montré que la surexpression de miR-155 améliore l'expression de PD-L1, réduit les cellules immunitaires du sang périphérique, induit l'apoptose et le dysfonctionnement des lymphocytes T CD8+ via la déphosphorylation AKT/ERK et diminue la survie des patients atteints de DLBCL. Il a également été démontré que l'histone désacétylase 3 (HDAC3) est un autre régulateur épigénétique important de PD-L1 dans le lymphome à cellules B car son inhibition augmente la transcription de PD-L1, entraînant une meilleure réponse clinique au blocage de PD-L1 [301].

Les mécanismes moléculaires de l'environnement immunitaire dans la régulation de l'efficacité des blocages des points de contrôle immunitaires dans le lymphome à cellules B sont mal compris. Il a été démontré que les tumeurs enflammées par les lymphocytes T sont enrichies pour la sensibilité à la thérapie de blocage de PD-1 [302].À l'inverse, les tumeurs non enflammées à cellules T présentent des cellules immunitaires peu infiltrantes et sont généralement résistantes à la thérapie de blocage des points de contrôle immunitaires [303]. Les lymphomes enflammés sont caractérisés par la présence d'une infiltration importante de cellules T [304], d'altérations génétiques qui facilitent l'évasion de la surveillance immunitaire [78,82,305,306] et de mutations fréquentes, entraînant une hyperactivité de la voie de signalisation NF-kB [78,307].

Une maladie hyperprogressive a été retrouvée chez 9 % des patients ayant reçu un traitement anti-PD-1/PD-L1 [308 309]. L'hyperprogression est associée à l'âge des patients mais pas à la charge tumorale ou au type de cancer [308]. L'amplification de MDM2/MDM4 et l'aberration de l'EGFR sont corrélées à un risque plus élevé d'hyperprogression dans les cancers solides [309], alors qu'elle était peu connue dans les lymphomes. Des données récentes ont montré que les patients présentant une hyperprogression ont une prévalence plus élevée de la maladie PD-L1 − [308]. Il est prévu que cela soit dû au fait que l'engagement de PD-1 avec un mAb anti-PD-1 inhibe mais n'augmente pas les activations des lymphocytes T. Par conséquent, les mAb anti-PD-1 pourraient être des agonistes de PD-1 plutôt que des antagonistes dans le statut PD-L1 −. La maladie pourrait également progresser rapidement par interaction entre PD-L1 et CD80 au lieu de PD-1 pendant la durée de blocage par les mAb anti-PD-1 dans le statut PD-L1+ [310]. Certains polymorphismes de PD-1 pourraient également affecter l'action des AcM anti-PD-1 et, ainsi, une hyperprogression pourrait être possible après le blocage de PD-1 [311].


Résultats

Conception et préparation des domaines solubles SIRPα et CD47

Pour récapituler l'interaction biologique de CD47 et SIRPα, nous avons conçu des constructions d'expression pour produire leurs domaines d'interaction extracellulaires recombinants solubles. Le CD47-CD4-6His a été produit dans un système d'expression de mammifère et il a déjà été démontré qu'il se lie à la SIRPα recombinante [77]. Comme prévu, le CD47-CD4-6His recombinant était hautement glycosylé, migrant sous forme de bande diffuse à

60 kDa, par rapport au poids moléculaire de 40 kDa prédit à partir de la séquence protéique (S1 Figue). L'hétérogénéité de la glycosylation du CD47 n'a pas d'effet rapporté sur sa capacité à se lier à SIRPα [78].

La SIRPα non glycosylée se lie au CD47 avec une affinité nM élevée [78]. Cependant, la SIRPα recombinante contenant une glycosylation anormalement élevée et hétérogène a montré une liaison altérée de CD47 [79]. Pour réduire la variabilité des tests biologiques, nous avons choisi de produire SIRPα dans un système déficient en glycosylation. SIRPα-Avi (Isoform 1 allele 1) est exprimé en E. coli en tant que construction de fusion qui comprend une étiquette de purification N-terminale suivie du fragment extracellulaire de liaison à CD47 de SIRPα lié à un Avi-Tag C-terminal. Après capture par affinité et clivage du tag, SIRPα-Avi a été biotinylé in vitro (SIRPα-biotine) en utilisant un recombinant purifié E. coli la biotine ligase (BirA) à >98% d'incorporation, telle que mesurée par spectrométrie de masse (S2 Fig). La protéine purifiée est monomérique comme jugé par SEC. Études de diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) (voir Fichier S1(S3 Fig).

Pour valider l'interaction biologiquement pertinente entre nos réactifs PPI, nous avons utilisé la spectroscopie SPR pour mesurer leur affinité de liaison à l'état d'équilibre (Figure 2). SIRPα-biotine a été immobilisé sur une puce SAV avec CD47-CD4-6His injecté à plusieurs concentrations pour produire un K d'environ 200 nM. Ceci est comparable à un rapport précédent de 300 nM et 279 nM utilisant des constructions similaires et une mesure via SPR [66,80] et 470 nM pour la liaison soluble de CD47 aux cellules CHO exprimant SIRPα mesurée par l'intensité de fluorescence [81].

La SIRPα-biotine a été immobilisée sur une puce SAV suivie d'une injection de CD47-CD4-6His à des concentrations variables. (A) Les réponses d'association et de dissociation sont présentées sous forme de superposition pour chaque concentration testée. (B) La réponse maximale de la phase d'association a été tracée en fonction de la concentration et ajustée à une courbe de liaison à l'état d'équilibre pour se rapprocher du K du couple d'interaction.

Développement de tests

Nous avons développé un test TR-FRET pour mesurer quantitativement l'interaction de CD47 et SIRPα [82]. Nous avons commencé avec les réactifs TR-FRET de CisBio pour des études de faisabilité et d'optimisation. Le réactif donneur consiste en un anticorps monoclonal anti-6His marqué avec un cryptate de Terbium (61HI2TLA) pour fournir un signal fluorescent de longue durée lié à l'étiquette 6His du CD47 (Figure 3A). L'accepteur est constitué de streptavidine marquée avec un fluorochrome XL665 (SAV-XL665 610SAXLA) à associer au marqueur biotine sur SIRPα. Des tests de faisabilité ont été effectués dans un format de 384 puits pour évaluer la spécificité du signal par rapport au bruit de fond et du dosage. En utilisant le K déterminé expérimentalement comme point de départ (voir Figure 2), des concentrations de CD47 et de SIRPα de 100 nM ont donné un S/B de 5 par rapport au même mélange dépourvu de CD47 (Figure 4A). Pour trouver la concentration optimale de réactifs protéiques pour chaque dosage, chaque composant a été titré à saturation (Figures 4B et 4C). Nous avons ensuite miniaturisé les volumes de test pour une utilisation au format 1536 puits et avons procédé à des tests de faisabilité et à une optimisation supplémentaire du test (Figure 4D). Enfin, en utilisant les concentrations de protéines ligand ajustées, nous avons optimisé les niveaux de tampon de dosage, de donneur et d'accepteur, le type de plaque, l'ordre d'ajout des réactifs et le temps d'incubation (Tableau 1 et S4 Fig). En bref, nous avons constaté que les concentrations en nM de CD47 (12,5 nM) et de SIRPα (100 nM) dans du tampon PBS avec un minimum de détergent (0,005% IGEPAL CA-630) et de BSA (0,1%) produisaient un test robuste.

Tests basés sur TR-FRET (panneau supérieur) et test ALPHAScreen (panneau inférieur). CD47 et SIRPα représentés comme leurs structures cristallines aux rayons X de PDB 2JJS, chaîne D et chaîne B, respectivement.

(A) Faisabilité du test initial réalisé dans un format de plaque de 384 puits à l'aide des réactifs CisBio TR-FRET. CD47 et SIRPα ont été testés à 2 concentrations (20 nM et 100 nM), et le rapport FRET de la réaction complète a été comparé à des contrôles dépourvus de CD47 ou de SIRPα pour calculer le S/B (n = 16). Les concentrations de (B) CD47 ou (C) SIRPα ont été titrées tandis que l'autre a été fixée comme indiqué en (A) dans des plaques à 384 puits pour trouver leurs concentrations de dosage optimales telles que jugées par S/B (n = 4). (D) Performances du test dans des formats de 384 puits ou 1536 puits comparés à l'aide de concentrations optimisées dérivées des panneaux B et C. Test Z 'indiqué pour chaque type de plaque (n = 32).

Deuxièmement, nous avons développé le test LANCE (LANthanide Chelate Excite) TR-FRET, qui consiste en un anticorps monoclonal anti-6His lié à un Eu-chélate (Anti-6His-Eu AD0110) pour le donneur associé au réactif CD47 et à la streptavidine liée à l'allophycocyanine (SAV-APC AD0201) comme accepteur associé à SIRPα. En utilisant les concentrations optimisées de CD47 et de SIRPα de l'optimisation du dosage CisBio comme point de départ, les réactifs du dosage LANCE ont été titrés au format 1536 puits pour arriver à un S/B de 12 (Tableau 4 et S5 Fig) en utilisant les conditions optimales décrites dans Tableau 1. Comme pour le test CisBio (S4 Fig), le critère d'évaluation est stable (≥ 80 % du signal initial) pendant au moins 48 h (S6 Fig).

Troisièmement, nous avons développé le test AlphaScreen en tant que test orthogonal de validation croisée. Il utilise une technologie de canalisation d'oxygène luminescente à base de billes [83] basée sur le transfert d'énergie de la bille donneuse excitée par laser (680 nm) aux billes acceptrices sous forme d'oxygène singulet pour produire un signal luminescent (520-620 nm) [84,85]. L'oxygène singulet a une durée de vie limitée (demi-vie de 4 sec) avant de revenir à l'état fondamental pendant lequel il peut diffuser environ 200 nm en solution. Si une perle acceptrice se trouve à cette distance, l'énergie est transférée de l'oxygène singulet aux dérivés de thioxène à l'intérieur de la perle acceptrice, aboutissant par la suite à une production de lumière à 520-620 nm. En l'absence d'une perle acceptrice, l'oxygène singulet se détend à l'état fondamental et aucun signal n'est produit. Ce transfert d'énergie chimique dépendant de la proximité est à la base du format homogène d'ALPHAScreen (Figure 3).

Le test ALPHAScreen a été optimisé en utilisant les concentrations de CD47 et de SIRPα du développement du test CisBio comme point de départ. Alors que la concentration optimale de CD47 est restée inchangée tout au long des trois tests, la concentration optimale de SIRPα est 4 fois inférieure pour le test ALPHAScreen, probablement en raison des différences de capacité de liaison des billes SAV par rapport à la streptavidine en solution. L'optimisation a également permis une concentration de billes 2 fois inférieure à celle suggérée par le fabricant, réduisant le coût par point de données [86]. Le test ALPHAScreen résultant a donné des paramètres HTS robustes (Z' de 0,79, S/B = 75 Tableau 4), un temps de lecture légèrement plus rapide que les tests TR-FRET (9 min/plaque contre 14 min/plaque), et un type de tampon et de plaque de test commun avec les tests CisBio et LANCE (Tableau 1).

Validation du dosage

Nous avons évalué les performances des trois tests dans un format qHTS en utilisant SIRPα-froid (non biotinylé) comme inhibiteur spécifique de l'interaction SIRPα-CD47. Le CI50 les valeurs présentaient un bon accord avec celles obtenues à partir du test TR-FRET (2,8 M et 1,1 M pour CisBio et LANCE, respectivement) et le test ALPHAScreen (0,55 M Figure 5A). Les pentes des collines indiquent une interaction bimoléculaire presque idéale (1,2–1,5, Figure 5A). Nous avons également évalué la capacité d'une petite molécule à agir comme inhibiteur dans le test, car l'objectif éventuel du test HTS sera de cribler de grandes bibliothèques chimiques pour les petites molécules antagonistes de l'interaction protéine-protéine entre SIRPα-CD47. Comme il n'y a pas d'inhibiteurs connus de petites molécules de cette interaction, nous avons choisi d'utiliser de la biotine libre pour inhiber l'interaction entre SIRPα et les réactifs de dosage conjugués à la streptavidine. De la biotine libre a été ajoutée à l'avance au complexe SIRPα-CD47 avant l'ajout du réactif conjugué à la streptavidine pour surmonter la vitesse d'arrêt extraordinairement lente du complexe une fois formé [87]. L'activité de la biotine était similaire pour tous les tests et présentait le même classement de puissance inter-test que la grande molécule SIRPα-froid (AlphaScreen>LANCE>CisBio Figure 5B). Le CI50 les valeurs de 260, 170, 115 nM étaient comparables aux résultats générés par Perkin Elmer pour des tests similaires évaluant l'interférence de la biotine dans les milieux de test [88]. La coopérativité indiquée par la pente de Hill comprise entre 2 et 3 est probablement due à la multivalence de la streptavidine et reflète la nécessité de bloquer plusieurs sites avant que le signal de proximité ne soit éliminé. Cela contraste avec l'interaction de SIRPα-cold avec l'anticorps bivalent CD47-CD4-6His/anti-His montré ci-dessus. La robustesse du test indiquée par le facteur Z’ était « excellente » [74] (voir Tableau 4) et a permis de passer au criblage pilote à l'aide de la bibliothèque LOPAC de 1280 composés (Sigma).

(A) La spécificité du test a été validée à l'aide de SIRPα-titré à froid pour inhiber l'activité de liaison au CD47 de SIRPα-biotine dans les tests de dépistage. Pente et IC50 sont indiqués (n = 4). (B) Les performances du test utilisant une petite molécule de contrôle positif (biotine) ont été évaluées dans les trois tests (n = 1). Activité normalisée calculée avec un contrôle neutre (+CD47, +SIRPα, pas d'inhibiteur) à 0% et un contrôle faible (-CD47 +SIRPα, pas d'inhibiteur) à -100% d'activité. L'activité de dosage avec les agents testés a ensuite été comparée et normalisée à ces contrôles.

Comparaison des tests de dépistage pilote

La bibliothèque LOPAC a été testée au format qHTS à l'aide d'un titrage interplaque en 7 points allant de 38 µM à 2,4 nM (concentration finale) au format 1536 puits. Tous les tests ont affiché des performances robustes à en juger par le facteur Z', une mesure statistique des séparations des distributions de contrôle positif et négatif. Le Z' a été déterminé en utilisant les colonnes 1 et 2 de chaque plaque comme contrôles positifs et négatifs, respectivement (Figs 6 et 7).

Résultats des tests (A) CisBio, (B) LANCE et (C) AlphaScreen affichés. Points de données de signal individuel du contrôle neutre (+CD47, +SIRPα, pas d'inhibiteur) et du contrôle faible (+CD47 -SIRPα, pas d'inhibiteur) tracés par puits pour chaque plaque dans l'analyse pilote de 10 plaques (n = 32 points par plaque ). Les lignes pointillées représentent + et – 20 % du signal moyen pour chaque contrôle haut et bas. Le facteur Z' a été calculé à partir des contrôles haut et bas sur chaque plaque et moyenné sur toutes les plaques.

Résultats des tests (A) CisBio, (B) LANCE et (C) AlphaScreen affichés. SIRPα-froid a été titré comme inhibiteur de contrôle dans chaque dosage (n = 2). Les barres d'erreur représentent l'écart type de deux réplicats. Le CI moyen50 et le rapport significatif minimum (MSR) a été calculé sur l'analyse de 10 plaques pour chaque test de dépistage. Le MSR est défini comme le plus petit rapport entre les puissances de deux composés qui est statistiquement significatif et est calculé comme MSR = 10 2√2s , où s est une estimation de l'écart type d'un log de puissance pour un composé.

L'activité des composés de la bibliothèque a été analysée selon la classification de la courbe (cc) comme décrit précédemment [89,90]. En bref, les composés étaient considérés comme actifs lorsqu'ils présentaient soit une inhibition dépendante de la concentration avec deux asymptotes et une activité incomplète (-50-90% cc -1,2), soit une activité complète aux concentrations testées les plus élevées (<-90% cc -2,1) inhibition avec deux asymptotes indiquant un effet saturable (<-90% cc -1.1), comme indiqué dans Tableau 5. L'activité globale la plus élevée a été démontrée dans l'AlphaScreen (17 sur 1280 1,3% Figure 8) suivi du dosage CisBio TR-FRET (15 sur 1280 1,2 %) et du dosage LANCE TR-FRET (3 sur 1280 0,2 %).

Résultats affichés à l'aide des tests (A) CisBio, (B) LANCE et (C) AlphaScreen. Les courbes de réponse de concentration adaptées aux données de composés actifs à l'aide d'une équation logistique à 4 paramètres sont incluses avec des lignes pleines. Les lignes noires indiquent une activité uniquement dans le test indiqué. Les lignes bleues indiquent l'activité dans les tests CisBio et AlphaScreen. Les lignes rouges indiquent l'activité dans les trois tests.

Nous avons en outre caractérisé l'activité de ces composés avec des lectures de tests supplémentaires, des tests de contre-dépistage, les caractéristiques des données et la promiscuité des composés signalée. L'interférence du test par la matière chimique peut prendre de nombreuses formes dans les tests HTS biochimiques [91,92] et peut être médiée par la fluorescence ou l'agrégation de composés, l'atténuation du signal par l'absorbance, ou la désactivation de l'oxygène singulet et la perturbation du marqueur d'affinité dans le cas de l'AlphaScreen.

Dans les tests TR-FRET, des composés fluorescents ou des atténuateurs ont été identifiés à l'aide d'une lecture supplémentaire des données de fluorescence du canal donneur. Les changements dans la fluorescence du donneur qui reflètent ou contribuent à l'activité globale (rapport FRET/donneur) indiquent une interférence avec le dosage et ces composés ont été retirés d'un examen plus approfondi [93]. Des artéfacts des canaux donneurs ont été observés pour 14 des 15 molécules actives du test CisBio (Figure 9), et pour 2 des 3 actifs LANCE (Figure 10), résultant en 6-hydroxy-DL-DOPA comme le seul candidat restant dans les deux tests TR-FRET, qui est connu pour avoir une activité dans un certain nombre de tests non apparentés et est considéré comme une molécule de promiscuité. Pour les composés actifs sur AlphaScreen, nous avons utilisé un test de contre-écran supplémentaire (TruHits, Perkin Elmer) où la paire d'interaction SIRPα et CD47 marquée a été remplacée par un seul peptide à double marquage (Biotine-peptide-6XHis). Les composés présentant une activité dans ce contre-écran ne perturbent pas spécifiquement l'interaction SIRPα-CD47 mais sont plutôt des perturbateurs d'étiquettes d'affinité, des extincteurs d'oxygène singulet ou de fluorescence, ou éventuellement des agrégateurs de protéines. En conséquence, 3 des 17 molécules actives ont affiché une activité de contre-écran et ont été retirées d'un examen plus approfondi (Fig 11).

Signal d'activité normalisé pour les canaux donneur et accepteur et signal de rapport calculé pour chaque composé actif rapporté pour la réponse de concentration en 7 points générée à l'aide de qHTS. L'activité normalisée a été calculée avec un contrôle neutre (+CD47 + SIRPα, pas d'inhibiteur) à 0% et un contrôle faible (+CD47 -SIRPα, pas d'inhibiteur) à -100% d'activité. L'activité de dosage avec les composés testés a ensuite été comparée et normalisée dans cette plage. (A) Composés qui ont interféré avec la fluorescence du donneur indiquée par l'activité dans le canal du donneur. (B) Composé réactif actif dans une variété d'autres tests de criblage non apparentés.

Signal d'activité normalisé pour les canaux donneur et accepteur et signal de rapport calculé pour chaque composé actif rapporté pour la réponse de concentration en 7 points générée à l'aide de qHTS. L'activité normalisée a été calculée avec un contrôle neutre (+CD47 + SIRPα, pas d'inhibiteur) à 0% et un contrôle faible (+CD47 -SIRPα, pas d'inhibiteur) à -100% d'activité. L'activité de dosage avec les composés testés a ensuite été comparée et normalisée dans cette plage. (A) Composés qui ont interféré avec la fluorescence du donneur indiquée par l'activité dans le canal du donneur. (B) Composé réactif actif dans une variété d'autres tests de criblage non apparentés (Pubchem).

Signal d'activité normalisé pour le dosage AlphaScreen spécifique (Alpha) et le dosage de criblage de compteur non spécifique (compteur) pour chaque composé actif rapporté pour la réponse de concentration en 7 points générée à l'aide de qHTS. L'activité normalisée dans le test AlphaScreen a été calculée avec un contrôle neutre (CD47 + SIRPα, pas d'inhibiteur) à 0% et un contrôle négatif (CD47-SIRPα, pas d'inhibiteur) à -100% d'activité. L'activité normalisée dans le test de filtrage de compteur a été calculée avec un contrôle neutre (+ réactif TruHits, pas d'inhibiteur) à 0% et un contrôle négatif (réactif -TruHits, pas d'inhibiteur) à -100% d'activité. L'activité de dosage avec les composés testés a ensuite été comparée et normalisée dans cette plage. (A) Composés qui ont interféré avec le test, comme indiqué par une activité significative dans le test de contre-écran. (B) Composés réactifs identifiés comme actifs dans une variété d'autres tests de criblage non apparentés.

Les molécules actives restantes ont été examinées plus en détail pour un comportement non idéal qui indiquerait un mécanisme autre que l'antagonisme CD47-SIRPα. Un mécanisme maintenant bien connu d'interférence de dosage implique des molécules qui ont tendance à s'agréger dans des tampons de dosage aqueux et à adsorber les réactifs de dosage pour entraîner une activité inhibitrice apparente [94-96]. Comme ce phénomène se produit à un seuil où la molécule d'essai atteint sa limite de solubilité, les courbes concentration-réponse présenteront une pente de Hill raide près de la limite de solubilité [94]. Les pentes de Hill sont alors un indicateur d'activité non spécifique, et les composés ont été signalés comme des inhibiteurs non idéaux lorsqu'ils ont affiché des pentes de Hill en dehors de la plage de -0,5 à -1,5, étant entendu que cela n'identifie pas définitivement les molécules problématiques en tant qu'agrégateurs. 97]. Pour éviter l'agrégation des composés et les interférences de dosage associées, tous les dosages primaires et les tests de suivi ont été effectués avec du détergent présent [97, 98].

Dans le cas de la seule molécule active dans les dosages TR-FRET (6-hydroxy-DL-DOPA), sa pente de Hill se situe dans la tolérance pour les dosages CisBio et LANCE.Parmi les actifs AlphaScreen, l'acide aurintricarboxylique, la céphalosporine C, l'Apresoline, l'Indirubine-3'-oxime, le 2,2'-Bipyridyl, le CGS-15943, le chlorhydrate de L-Histidine et le rouge de ruthénium ont tous affiché des pentes de Hill en dehors de nos critères d'acceptation et ont été mis au rebut. Les actifs restants (morin, rotterlin, 1,10-Phénanthroline monohydraté, acide quinolinique, acide fusarique et 6-hydroxy-DL-DOPA) ont des caractéristiques PAINS ([91,99,100] et la base de données ChEMBL) qui les rendraient probablement faux positifs et inadaptés au suivi. La 6-hydroxy-DL-DOPA est également suspectée d'interférence avec le dosage en raison de son activité d'agrégation (voir ci-dessus) et dans d'autres études [101], des caractéristiques du PAINS (telles que définies dans la base de données ChEMBL), de la réactivité redox connue et de la promiscuité du dosage (actif dans 119 des 386 tests dans Pubchem [102] au moment de la préparation du manuscrit). Malgré son activité d'interférence bien connue dans les tests, l'activité de la 6-hydroxy-DL-DOPA dans nos tests correspondait à celle d'un composé à succès bien comporté, et c'était également la seule molécule constamment active dans tous les tests qHTS. Il a donc été sélectionné pour des tests de suivi.

Un échantillon de poudre fraîche de 6-hydroxy-DL-DOPA a été acquis auprès du fournisseur et authentifié par HPLC-MS à partir d'un stock de DMSO 10 mM. Les tests de suivi dans les tests qHTS ont donné une activité similaire sinon légèrement plus puissante (Figure 12 CisBio et AlphaScreen). Le composé a ensuite été évalué pour l'activité perturbatrice de SIRPα-CD47 dans le test SPR décrit précédemment (vide infra) mais n'a pas réussi à inhiber l'interaction protéine-protéine dans des conditions similaires à celles des tests qHTS.

Résultats affichés pour les tests (A) CisBio, (B) LANCE et (C) AlphaScreen. Des tests de suivi ont été effectués en utilisant un composé fraîchement plaqué provenant de stocks de poudre dans une réponse de concentration de 11 points (n = 1).

Comme mentionné ci-dessus, la 6-hydroxy-DL-DOPA est un agrégateur connu. Ce type d'interférence devrait entraîner une activité dans le test de dépistage du compteur AlphaScreen. Cependant, nous n'en avons trouvé aucun dans notre test, en suivant le protocole du fabricant. Dans cette expérience, le peptide témoin est prémélangé à la fois avec les billes acceptrices et donneuses pour former le complexe et ensuite ajouté aux puits de dosage suivi des composés. Dans ces conditions, le complexe perle-peptide préformé peut être cinétiquement et physiquement insensible au composé agrégé. Par comparaison, dans le test primaire, les protéines réactives sont exposées au composé agrégé avant l'ajout de billes. Pour déterminer sans ambiguïté si la 6-Hydroxy-DL-DOPA présentait une activité interférente dans l'écran du compteur, nous avons modifié le protocole pour qu'il corresponde plus étroitement au test principal. Dans ces conditions révisées (counter screen v.2), le peptide est d'abord ajouté dans les puits, suivi du composé, puis des billes (Figure 13). Les conditions révisées ont révélé une activité dans le test de criblage de compteur v.2 qui était similaire au test de criblage primaire et a identifié la 6-hydroxy-DL-DOPA comme une molécule interférente. Par conséquent, il a été éliminé d'un examen ultérieur. En conclusion, aucun composé n'a été identifié comme inhibiteur spécifique de l'interaction CD47-SIRPα à partir de l'étude pilote de criblage. Cependant, nous avons développé des tests et des contre-tests qui excluent de nombreux composés interférents et qui peuvent être appliqués à de plus grandes collections chimiquement diversifiées et à des campagnes de dépistage.

Activité montrée en utilisant le test CD47-SIRPα PPI (panneau de gauche) et le test de criblage de compteur exécuté sous différentes séquences d'ajout de réactif (panneau de droite).

Performances de test dans une grande bibliothèque qHTS entièrement automatisée

Nous avons testé les performances des tests ci-dessus positionnés dans le cadre d'une campagne qHTS à grande bibliothèque entièrement automatisée. Nous avons utilisé un criblage primaire avec des dosages en aval de compteur et de criblage orthogonal capables d'identifier les artefacts de dosage à partir de composés actifs dans le criblage primaire. Pour le criblage principal, nous avons choisi le test LANCE TR-FRET car il présentait le meilleur facteur Z' et le profil d'interférence composé le plus faible lors du criblage pilote (Figure 14). En tant que contre-écran, nous avons utilisé le test LANCE TR-FRET avec un peptide 6XHis-biotine à la place de l'interaction SIRPα-CD47 (comme dans le test de contre-écran AlphaScreen décrit ci-dessus). Cela a permis d'évaluer les composés interférant avec le dosage avec les mêmes réactifs TR-FRET que le criblage principal. Un criblage orthogonal a été utilisé pour confirmer les composés actifs et a été réalisé en utilisant le test d'interaction AlphaScreen SIRPα-CD47 comme décrit ci-dessus. Pour tester cette configuration d'essai, nous avons criblé un grand (94 965 composés), divers (1 000 échafaudages qui varient en représentation de 20 à 100 composés par chémotype), hautement organisé (PAINS, Lipinsky), semblable au plomb (enrichi en sp3, spirocyclique, nouveaux chémotypes) bibliothèque chimique (Genesis, NCATS) formatée sous la forme d'une réponse de concentration interplaque à 6 et 7 points dans des plaques sources de 1536 puits. Le criblage a été effectué avec le groupe d'automatisation du NCATS à l'aide de la plate-forme robotique Kalypsis entièrement automatisée utilisant le même équipement de distribution de liquide, d'épinglage composé et de mesure du point final que celui utilisé hors ligne dans le criblage pilote. Dans ce format, le criblage primaire a été réalisé sur 409 plaques au cours de 4 jours de criblage. Le deuxième jour de criblage comprenait 200 plaques se traduisant par un débit maximal de plus de 40 000 composés par jour dans des réponses de concentration en 6 et 7 points. Le test principal était robuste (S/B = 17,6 ± 2,2, CV = 2,0 % ± 0,6 et un Z′ de 0,93 ± 0,3 Figure 14A) tel que calculé à partir des puits témoins de chaque plaque de la série.

(A) Facteur Z' calculé à partir des contrôles intraplaques. (B) Activité normalisée de tous les composés testés dans une réponse de concentration en 6 points. Les courbes rendues représentent tous les composés affichant une activité avec une classe de courbe négative. Les courbes rendues en rouge ont une activité maximale ≤-25%.

En raison du faible niveau d'activité dans le criblage, les composés ont été sélectionnés pour les études de suivi s'ils présentaient une classification de courbe négative (toutes les courbes dans Figure 14B) et une réponse normalisée maximale de <-25% (courbes rouges dans Figure 14B). Cela a abouti à 12 composés sélectionnés pour les tests de suivi. Ces composés, sélectionnés à partir de stocks chimiques, ont été utilisés pour fabriquer les plaques de la bibliothèque, étalées dans un format de réponse de concentration en 11 points allant de 38 M à 37 nM, et confirmées hors ligne à l'aide du test de criblage primaire TR-FRET (Fig 15). Les tests hors ligne ont confirmé 8 des 12 actifs identifiés dans l'écran principal. Les 4 composés qui n'ont pas été confirmés ont affiché une courbe de classe -4 et n'étaient actifs qu'à la concentration la plus élevée dans l'écran principal. Ces résultats ont fourni un autre exemple de la valeur du dépistage au format qHTS et de la possibilité d'utiliser la concentration-réactivité comme filtre d'activité précoce. Les composés actifs restants ont été soumis à une enquête supplémentaire en utilisant le test de criblage de compteur basé sur TR-FRET pour éliminer les composés faussement positifs interférant avec le test. Trois composés ont présenté une activité inacceptable dans le test de dépistage du compteur (même classification de courbe ou activité maximale que le dépistage principal) et ont été retirés des tests de suivi. Les composés restants ont ensuite été soumis à un test de dosage orthogonal en utilisant le dosage d'interaction AlphaScreen SIRPα-CD47 et 5 ont été confirmés comme ayant une activité similaire à celle du criblage primaire. Les identités chimiques des composés actifs confirmés feront l'objet d'un rapport de suivi résultant de leur caractérisation et optimisation en cours.

Panneau de gauche : schéma du processus de criblage montrant la taille de la bibliothèque d'entrée, l'utilisation du test, les composés avancés (flèche verte) et les composés non avancés (flèche rouge). Panneau de droite : profils d'activité pour les composés sélectionnés pour les tests de suivi à partir de l'écran principal. Les activités sont présentées pour chaque essai effectué et les profils de composés sont séparés par niveau d'avancement de l'essai. (A) Aucune activité sur le suivi TR-FRET. (B) Activité d'écran de compteur inacceptable. (C) Confirmé actif avec AlphaScreen.


Cellules sénescentes et macrophages : acteurs clés de la régénération ?

Au cours de la dernière décennie, notre compréhension du rôle physiologique des cellules sénescentes a considérablement évolué, passant de simples indicateurs de stress cellulaire et de vieillissement à un rôle central dans la régénération et la réparation. De plus en plus, des études ont identifié les cellules sénescentes et le phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP) comme étant essentiels dans le processus de régénération après une blessure. Cependant, le moment et le contexte dans lesquels le programme de sénescence est activé peuvent conduire à des résultats distincts. Par exemple, une induction transitoire de cellules sénescentes suivie d'une élimination rapide aux premiers stades suivant une blessure favorise la réparation, tandis que l'accumulation à long terme de cellules sénescentes altère la fonction tissulaire et peut entraîner une défaillance d'un organe. Un rôle clé du SASP est le recrutement de cellules immunitaires sur le site de la lésion et l'élimination subséquente des cellules sénescentes. Parmi ces types de cellules se trouvent les macrophages, qui ont des rôles régulateurs bien documentés à toutes les étapes de la régénération et de la réparation. Cependant, alors que le rôle des cellules sénescentes et des macrophages dans ce processus commence à être exploré, les interactions spécifiques entre ces types de cellules et leur importance dans les différentes étapes de la blessure/réparation nécessitent encore une enquête plus approfondie. Dans cette revue, nous examinons la littérature actuelle concernant l'interaction de ces types de cellules, comment leur coopération est importante pour la régénération et la réparation, et quelles questions restent sans réponse pour faire avancer le domaine.

1. Introduction

La réparation et la régénération des tissus sont des processus biologiques critiques qui se produisent après une blessure et sont essentiels à la survie. Les blessures peuvent survenir à la suite d'une infection, d'une agression toxique ou mécanique, et entraînent une activation importante du système immunitaire et le recrutement d'un grand nombre et de types de cellules, qui s'infiltrent dans la zone endommagée. Ceux-ci se composent de cellules tueuses naturelles, de macrophages, de neutrophiles, de cellules B, de cellules T, de fibroblastes, de cellules épithéliales et de cellules endothéliales. Dans un environnement sain, ces cellules travaillent ensemble dans un effort concerté pour restaurer la fonction des tissus et limiter les dommages, un processus qui doit être étroitement régulé. Dans de nombreux environnements pathologiques, ces mécanismes deviennent dérégulés et le recrutement de cellules immunitaires peut à la place initier, amplifier et même entretenir des lésions tissulaires. Ce processus de guérison des tissus endommagés est connu sous le nom de « réparation » et englobe les deux processus distincts de régénération et de remplacement, où la régénération fait référence au processus au cours duquel la croissance d'un nouveau tissu restaure les zones de tissu endommagé à leur état d'origine tandis que le remplacement se produit dans un tissu gravement endommagé. , souvent sous forme de cicatrices.

Alors que la cascade inflammatoire sert à éliminer le stimulus nocif et à nettoyer la zone blessée des cellules mortes et des débris de matrice, la guérison des tissus blessés dépend de la suppression rapide de l'inflammation, ouvrant la voie à l'activation des cellules réparatrices [1]. Cependant, l'efficacité de la réponse réparatrice dépend de la gravité et du type de blessure, de l'organe affecté et des caractéristiques spécifiques à l'espèce. Alors que les amphibiens peuvent régénérer les membres [2] et les poissons peuvent régénérer le myocarde [3], les mammifères adultes ne parviennent pas à régénérer l'un ou l'autre. De plus, chez les mammifères adultes, des organes tels que le foie conservent une certaine capacité de régénération [4], alors que la régénération du cerveau et de la moelle épinière est extrêmement limitée [5]. Pour ajouter à cette complexité, lorsque les tissus sont exposés à des blessures prolongées, le processus de réparation peut devenir chronique ou dérégulé, entraînant des processus pathologiques, notamment une fibrose ou une inflammation chronique, qui ont finalement un impact sur la fonction des organes et peuvent entraîner la mort d'un organe ou d'un organisme.

1.1. Sénescence cellulaire

Un résultat courant du processus de lésion est la sénescence cellulaire, une forme irréversible mais stable d'arrêt du cycle cellulaire, définie par un transcriptome altéré, qui se produit dans les cellules en prolifération lorsqu'elles ont atteint la fin de leur durée de vie réplicative ou lorsqu'elles sont soumises à un stress. Les cellules sénescentes sont souvent caractérisées par une forme agrandie et aplatie [6] et présentent des caractéristiques de sénescence, notamment des altérations de l'ADN et de la chromatine et des modifications de l'expression des gènes [7-11] un dysfonctionnement mitochondrial et la libération subséquente d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) [12 ,13] modifications protéiques [14] et accumulation de granules de lipofuscine [15] expression de la SA-β-galactosidase [16] et libération de facteurs SASP [14,17] (figure 1une). De plus, bien qu'elles soient souvent présentes dans les tissus lésés [27,28], les cellules sénescentes peuvent également être présentes dans les organes non lésés, en particulier dans les organes qui ont déjà subi des dommages ou une maladie [29], et en particulier chez les personnes âgées. La sénescence cellulaire a été découverte pour la première fois en culture cellulaire primaire, où les cellules cultivées pendant de longues périodes, apparentées au vieillissement, ont atteint un état où elles n'étaient plus capables de se répliquer [30,31]. Par la suite, des cellules positives pour la (SA)-β-galactosidase associée à la sénescence ont été observées dans les tissus âgés [16]. Pendant de nombreuses années après cela, la sénescence était uniquement considérée comme le résultat du vieillissement de l'organisme. Cependant, au cours de la dernière décennie, notre compréhension a considérablement évolué, indiquant que la sénescence cellulaire peut survenir en réponse à une gamme de stimuli, y compris des dommages cellulaires [18], stress oxydatif [32], signalisation oncogène [19], attrition des télomères [20], rayonnements ionisants [21] et certains médicaments anticancéreux [22] (figure 1b), et se voit même au cours du développement [23,24] (figure 1c). La sénescence a été rapportée dans de nombreux types cellulaires au cours du vieillissement naturel et après une blessure ou une maladie, notamment l'épithélium [33], l'endothélium [34], les cellules immunitaires [35], les cellules mésenchymateuses [36], les os [37], les muscles [38] et tissu adipeux [39]. Un rôle important de la sénescence est donc d'empêcher la propagation des dommages dans tout le tissu et, dans le cancer, agit comme une puissante barrière contre la tumorigenèse (revue dans [40]) (figure 1c). En général, l'induction transitoire de la sénescence suivie de l'élimination des cellules sénescentes favorise le remodelage et la régénération tissulaire [25,26] (figure 1c) cependant, les lésions chroniques peuvent entraîner l'accumulation à long terme de cellules sénescentes, entraînant une inflammation persistante qui altère finalement la fonction des tissus et peut contribuer à la défaillance d'un organe (figure 1c). Pour cette raison, l'équilibre fin des cellules sénescentes et leur présence/élimination est susceptible de jouer un rôle central dans la réparation tissulaire. Dans cette revue, nous nous sommes concentrés sur la littérature décrivant l'interaction entre la sénescence dans les tissus épithéliaux et les cellules immunitaires, en particulier les macrophages.

Figure 1. Les caractéristiques, causes et effets de la sénescence cellulaire. (une) Les principales caractéristiques d'une cellule sénescente, qui incluent une forme agrandie et irrégulière/aplatie [6], des segments d'ADN avec des altérations de la chromatine renforçant la sénescence (DNA-SCARS) [9] et des foyers [10], une expression génétique altérée [8] et arrêt du cycle cellulaire [7], dysfonctionnement mitochondrial et libération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) [12,13], modifications des protéines [14], granules de lipofuscine, expression de la SA-β-galactosidase [16] et libération de facteurs SASP [14 ,17]. (b) La sénescence cellulaire peut survenir en réponse à des dommages cellulaires ou à l'ADN [18], à la signalisation des oncogènes, des mitogènes et des cytokines [19], à l'attrition/au raccourcissement des télomères [20], aux rayonnements ionisants [21] et aux médicaments anticancéreux [22]. (c) La sénescence cellulaire joue un double rôle au cours du développement [23,24] et tout au long de la réparation et de la régénération des tissus [25,26], où elle peut favoriser l'élimination des débris cellulaires, réduire la fibrose, provoquer des altérations épigénétiques et agit comme une puissante barrière contre la tumorigenèse , tout en entraînant également une propagation de la sénescence, des dommages à l'ADN, d'autres lésions tissulaires et, finalement, une détérioration des tissus et des pathologies associées à l'âge. Créé avec Biorender.com.

1.2. Phénotype sécrétoire associé à la sénescence

Les cellules sénescentes sont souvent caractérisées par leur capacité à développer un phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP), une réponse pro-inflammatoire qui active et renforce le phénotype de sénescence dans les cellules environnantes, module la fibrose et favorise la régénération [41] (figure 1c). Le SASP consiste en un mélange complexe de protéases de la matrice extracellulaire, de facteurs de croissance, de chimiokines et de cytokines, qui ont un effet profond sur le microenvironnement tissulaire [42]. De tels composants SASP peuvent déclencher la sénescence dans les cellules voisines à la fois de manière autocrine [43,44] et paracrine [41,45], suggérant que la sénescence crée un microenvironnement inflammatoire qui peut conduire à l'élimination des cellules sénescentes. La sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, telles que l'interleukine-6 ​​(IL-6) et l'interleukine-8 (IL-8) [46], de chimiokines, telles que les protéines chimiotactiques des monocytes (MCP) et les protéines inflammatoires des macrophages (MIP) [42 ], et des facteurs de croissance, tels que le facteur de croissance transformant-β (TGF??) [47], provoquent une inflammation et recrutent des cellules immunitaires pour éliminer les cellules sénescentes.

1.3. Macrophages dans la réparation des tissus

Parmi la variété de types cellulaires qui orchestrent la réparation, il a été démontré que les macrophages présentent une activité régulatrice critique à tous les stades de la réparation et de la fibrose. Les macrophages sont recrutés sur le site de la lésion par des gradients de chimiokines et diverses molécules d'adhésion, où ils jouent leur rôle de cellules piégeuses qui phagocytent les débris cellulaires et les cellules envahissantes, aux côtés d'autres cellules apoptotiques, en réponse à une lésion tissulaire. Il est important de noter que les macrophages sont essentiels à la clairance des cellules sénescentes après une blessure [48,49], ainsi qu'une source importante de chimiokines, de métalloprotéinases matricielles (MMP) et d'autres médiateurs inflammatoires qui entraînent la réponse cellulaire initiale [50]. Les modèles actuels suggèrent que la sénescence initie la modélisation/remodelage des tissus en recrutant des cellules immunitaires via le SASP, où les macrophages éliminent les cellules sénescentes, permettant le repeuplement par les cellules progénitrices et la régénération du tissu endommagé [25,26,51]. Cependant, dans le cas de dommages persistants ou dans les tissus âgés, la clairance et la régénération peuvent être compromises en raison d'un mauvais recrutement des macrophages, d'une augmentation des cellules sénescentes ou même des dommages aux macrophages eux-mêmes. En effet, si les macrophages sont épuisés aux premiers stades de la réparation dans un certain nombre d'organes, la réponse inflammatoire est diminuée [52] et conduit à une réparation et une régénération moins efficaces [53,54].

Cette revue se concentre sur les découvertes récentes qui ont fait progresser notre compréhension des cellules sénescentes et des macrophages dans les lésions tissulaires, et sur l'importance de la coopération de ces cellules en tant qu'acteurs clés pour faciliter la régénération et la réparation des tissus.

2. Preuve du rôle des cellules sénescentes dans les lésions tissulaires

La sénescence est un état d'arrêt prolifératif irréversible, que les cellules subissent en réponse à une variété de stimuli néfastes, et est associé à des changements dans la morphologie, l'activité lysosomale, des alternances dans la structure de la chromatine (expression H2Ax) et l'activation du SASP [55] (figure 1une). Une grande partie de notre compréhension actuelle de la sénescence découle d'études sur la maladie ou le vieillissement. Cependant, un nouveau rôle de la sénescence dans la résolution des lésions tissulaires a récemment émergé. En effet, des cellules sénescentes ont été identifiées dans divers organes lésés, notamment le foie [28,47], les reins [56,57], le cœur [58], les muscles squelettiques [27] et les glandes salivaires [59], et ont largement été associée à la perte de la fonction tissulaire. Néanmoins, il a été rapporté que la présence de cellules sénescentes a des effets à la fois positifs et négatifs dans leur organe résident, en fonction de leur abondance et de leur durée (figure 1c), et nous fournit des informations importantes sur leur fonction physiologique. En effet, si la fonction de la sénescence est l'élimination des cellules, pourquoi les cellules ne subissent-elles pas la voie plus rapide et plus directe de l'apoptose, et pourquoi les cellules sénescentes ont-elles été sélectionnées au cours de l'évolution ? Cette question a conduit au concept émergent selon lequel les cellules sénescentes jouent un rôle important dans la réparation et le remodelage des tissus, fournissant une fonction finale avant de finalement subir elles-mêmes l'élimination [26].

2.1. Le rôle des cellules sénescentes dans la réparation tissulaire

À ce jour, deux approches principales ont été utilisées pour explorer le rôle des cellules sénescentes dans la réparation : les stratégies de déplétion génétique, où les cellules sénescentes sont supprimées du tissu, et par l'utilisation de sénolytiques, où des composés sont utilisés pour induire la mort des cellules sénescentes.

2.2. Stratégies de déplétion génétique

Pour distinguer le rôle des cellules sénescentes par rapport aux cellules apoptotiques dans les lésions tissulaires, Baker et al. [66] ont utilisé un modèle de souris progérique de « sénescence à l'apoptose » inductible, où les souris transgéniques expriment des protéines pro-apoptotiques sous l'expression du promoteur p16 INK4a. En administrant aux souris un « commutateur chimique », les cellules exprimant le marqueur associé à la sénescence p16 INK4a ont été converties en cellules apoptotiques in vivo. Fait intéressant, en plus d'observer une diminution du nombre de cellules sénescentes, Baker et al. [66] ont observé une réversion dans un certain nombre de pathologies liées à l'âge (figure 2), indiquant un rôle des cellules sénescentes dans la perturbation de l'homéostasie tissulaire. Cependant, en utilisant un modèle de souris similaire mais mécaniquement différent dans des études de cicatrisation des plaies cutanées, il a été montré par Demaria et al. [60] que le passage des souris de la sénescence à l'apoptose retardait significativement la cicatrisation des plaies et provoquait l'accumulation de plus grandes quantités de tissu fibreux dans les plaies (figure 2). Fait intéressant, chez les jeunes souris, une explosion transitoire de cellules sénescentes P16 INK4a + s'est produite pendant la cicatrisation normale des plaies et a disparu après la fermeture de la plaie, indiquant un rôle précoce des cellules sénescentes dans la guérison des plaies et l'impact négatif de leur élimination [60]. De même, la sénescence cellulaire se produit dans les myofibroblastes des plaies cutanées au cours du processus de cicatrisation, ce qui minimiserait l'étendue de la fibrose [61].

Figure 2. L'épuisement des macrophages ou des cellules sénescentes a des effets divers et opposés sur la régénération des organes. Les effets de l'épuisement des cellules sénescentes (une) ou l'épuisement des macrophages ou la prévention de l'accumulation (b) sont représentés. Dans de nombreux organes, le moment de l'épuisement des cellules a un rôle crucial sur le résultat de la régénération. Alors que la déplétion des cellules sénescentes retarde la cicatrisation des plaies cutanées et exacerbe la fibrose [60,61], l'effet de la suppression des macrophages pendant la cicatrisation des plaies dépend du temps [54] de la même manière tandis que la déplétion des cellules sénescentes conduit à la fibrose hépatique [28,62], la déplétion des cellules sénescentes les macrophages peuvent entraîner à la fois une réduction des cicatrices hépatiques et une fibrose, en fonction du moment [52]. De plus, l'élimination des cellules sénescentes n'a pas d'effets ou des effets largement positifs sur le muscle et le cœur [63] cependant, l'épuisement des macrophages entraîne des effets néfastes sur le cœur et la régénération musculaire [63-65]. Créé avec Biorender.com.

À l'appui de ces observations, des effets contrastés de la fonction des cellules sénescentes ont également été démontrés dans d'autres modèles de lésions tissulaires. Lorsque le foie est lésé, les cellules étoilées hépatiques deviennent sénescentes et produisent une cicatrice fibrotique stable [28] (figure 2). In vivo, ces cellules sénescentes sont identifiées à l'intérieur des lésions fibreuses cependant, les souris déficientes pour p53 et p16 INK4A montrent une fibrose accrue à la fois dans le foie et les reins [28,62]. Inversement, dans un modèle murin de NRAS G12 V oncogène, où les cellules sénescentes sont généralement éliminées par les monocytes et les macrophages, les souris immunodéficientes présentent une clairance réduite, entraînant des tumeurs hépatiques matures [67]. De plus, la souris transgénique p16-3MR, un modèle qui contient un promoteur p16 INK4a qui permet le traçage et l'élimination des cellules sénescentes a été utilisé pour démontrer que la délétion des cellules sénescentes réduit la douleur dans un modèle expérimental d'arthrose [68]. Surtout, un modèle de souris contenant le transgène INK-ATTAC, qui induit l'apoptose dans les cellules exprimant p16 INK4a, a établi que le traitement de clairance des cellules sénescentes prolongeait la durée de vie des souris mâles et femelles, retardait la tumorigenèse et atténuait la détérioration liée à l'âge de plusieurs organes. , y compris les reins, le cœur et la graisse, sans effets secondaires apparents [69].

2.3. Sénolytiques

L'utilisation de composés sénolytiques fournit également un mécanisme pour élucider le rôle des cellules sénescentes et en particulier, le moment précis de l'épuisement. Les preuves montrent que les sénolytiques peuvent entraîner l'expression de la SA-β-gal en culture cellulaire [70]. De plus, l'administration des composés sénolytiques ABT-737 ou Dasatinib plus Quercetin (DQ) in vivo induit l'apoptose dans les cellules sénescentes et conduit à une clairance dans la peau, les poumons et le système hématopoïétique de la souris, et améliore par la suite la réparation tissulaire [70-73]. De plus, l'administration de DQ favorise la survie des greffons de souris âgées [74].

Prises ensemble, ces études mettent en évidence les rôles opposés des cellules sénescentes dans les blessures et la réparation, et la variation de leur fonction en raison du moment, du degré et du type de blessure. En effet, de plus en plus de preuves suggèrent que la sénescence cellulaire est un processus dynamique en plusieurs étapes, progressant d'un état transitoire à un état stable d'arrêt du cycle cellulaire, dictant le résultat [75].

2.4. Le rôle du phénotype sécrétoire associé à la sénescence dans la réparation tissulaire

De plus, au-delà de l'effet direct sur la division et la clairance cellulaires, un mécanisme clé dans lequel les cellules sénescentes influencent les blessures passe par le SASP. Le sécrétome SASP comprend une grande variété de signaux solubles capables d'influencer l'inflammation, la réparation et la fibrose des tissus, notamment l'IL-1, l'IL-8, l'IL-6 et le facteur de croissance transformant bêta (TGF??). Le SASP est une réponse pro-inflammatoire qui active et renforce le phénotype de sénescence dans les cellules environnantes et donc médie la propagation de la sénescence dans tout le tissu, connue sous le nom de « sénescence de spectateur ». Grâce à un ensemble variable de cytokines et de chimiokines, la sénescence paracrine est induite et maintenue par des mécanismes qui génèrent des espèces réactives de l'oxygène (ROS) et la réponse aux dommages à l'ADN (DDR) [76]. Par exemple, il a été démontré que la sénescence paracrine exacerbe les lésions biliaires et altère la régénération du foie [47]. Lors de l'ablation partielle de la SASP, par l'intermédiaire du TGF?? inhibition, la prolifération des hépatocytes est augmentée, la fibrose est diminuée et la fonction hépatique globale est améliorée. En revanche, dans le modèle murin de lésion cutanée cutanée employé par Demaria et al., les auteurs ont identifié un effet positif du SASP [60]. Curieusement, grâce à la sécrétion du facteur SASP PDGF-AA, la fermeture des plaies cutanées s'est avérée accélérée, en favorisant la différenciation des myofibroblastes et la formation de tissu de granulation.

En effet, lorsque le SASP a été étudié pour la première fois, son rôle dans les blessures et la résolution n'était pas bien compris, car les composants semblaient être principalement pro-inflammatoires. Il a depuis été suggéré que la sénescence peut altérer la régénération par signalisation paracrine, laissant les cellules voisines incapables de compenser les dommages, entraînant une fibrose accrue et une capacité réduite de la réponse régénérative [47]. Cependant, il semble que les composants inflammatoires importants et les conséquences néfastes se produisent en grande partie lorsque la SASP est de longue durée et peuvent être bénéfiques lorsqu'elles sont transitoires, jouant ainsi un rôle essentiel dans le remodelage tissulaire aux premiers stades de la lésion. En effet, en 2017, Chiche et al. [29] ont montré que dans les lésions aiguës et chroniques, la libération du facteur SASP IL-6 par les cellules sénescentes permettait la reprogrammation des cellules satellites musculaires, indiquant un rôle du SASP dans la facilitation de la plasticité et de la réparation cellulaire. Il est important de noter que cela indique un rôle bénéfique du SASP dans la promotion de la plasticité cellulaire des populations de cellules souches lors d'une lésion musculaire aiguë, ainsi que dans le cadre pathologique de la détérioration musculaire [29].

2.5. Sénescence cellulaire en pluripotence

Pour compléter les résultats susmentionnés, une étude récente a démontré que les facteurs de reprogrammation OCT4, SOX2, KLF4 et cMYC peuvent induire la sénescence cellulaire et la production d'IL-6. in vivo, ce qui conduit à une reprogrammation plus efficace [77]. De plus, SASP peut favoriser une réponse pro-régénérative par l'induction de plasticité et de tige dans les cellules somatiques souches/progénitrices [78]. Ritschka et al. [78] ont montré qu'une exposition transitoire au SASP dans les kératinocytes primaires de souris provoquait une augmentation de l'expression des marqueurs des cellules souches et de la capacité de régénération in vivo. Cependant, une exposition prolongée au SASP a déclenché un arrêt de la sénescence qui a contré les stimuli régénératifs [78]. Il a ainsi été proposé qu'en cas de lésion, la cellule sénescente utilise le SASP pour induire une plasticité et une souche dans les cellules voisines, permettant le remplacement de la cellule sénescente une fois nettoyée et favorisant la régénération tissulaire [25]. Cependant, il est important de noter que lorsque ce processus est incontrôlé, la reprogrammation associée à la sénescence peut conduire à la formation de tumeurs en favorisant la souche cancéreuse [79]. En revanche, les facteurs SASP qui sont sécrétés par les cellules progénitrices cardiaques sénescentes (CPC) via la signalisation paracrine entraînent la sénescence de CPC par ailleurs sains. Dans ce contexte, l'élimination des cellules sénescentes chez les souris âgées ou chez les souris traitées par sénolytiques a abrogé la SASP et a entraîné l'activation des CPC résidents et une augmentation du nombre de cardiomyocytes Ki-67 EdU+ en prolifération, indiquant ainsi que l'élimination des cellules sénescentes les cellules peuvent atténuer la détérioration après une lésion cardiaque et contribuer à la capacité du cœur à se régénérer [58]. De plus, la suppression des effecteurs de sénescence p53 et p16 INK4a améliore l'efficacité de reprogrammation des fibroblastes humains en iPSC, suggérant que dans cet environnement, la sénescence a un effet négatif sur la plasticité [80]. Il est important de noter que ces différences quant à savoir si les cellules sénescentes sont bénéfiques / préjudiciables à la régénération mettent en évidence l'importance du moment auquel le programme de sénescence est activé et son rôle changeant au cours des différentes étapes de la réponse à la blessure.

À ce jour, le SASP est connu pour jouer un rôle important dans le développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies et la croissance tumorale, ce qui indique que le SASP a des rôles physiologiques plus complexes que nous ne le comprenons actuellement (examiné dans [81,82]). Ensemble, ces études démontrent que les cellules sénescentes jouent un rôle important dans les lésions et la régénération des tissus et peuvent à la fois favoriser et inhiber la réparation des tissus. Simplement, la preuve des effets positifs de l'élimination des cellules sénescentes provient des circonstances où les cellules sénescentes s'accumulent et entraînent des conséquences négatives. Inversement, une vague transitoire de cellules sénescentes semble jouer un rôle important dans la promotion de la réparation dans les premiers stades de la blessure. Dans l'ensemble, ces résultats soutiennent la compréhension que le programme de sénescence peut être un processus régénératif bénéfique, cependant, lorsqu'il est perturbé, il peut jouer un rôle préjudiciable. Par exemple, alors que la sénescence aiguë joue clairement un rôle important dans la prévention des tumeurs malignes et la promotion d'une réparation tissulaire réussie, l'accumulation de cellules chroniquement sénescentes contribue davantage aux blessures, aux maladies et au vieillissement.

3. Rôle des macrophages dans les lésions tissulaires

Alors qu'il a été démontré qu'une grande variété de types cellulaires jouent un rôle important dans les blessures et la réparation, ces dernières années, un intérêt particulier pour les macrophages s'est développé, en raison de la contribution de différentes populations de macrophages et de leur plasticité dans le contexte des blessures. Ainsi, ces dernières années, un accent particulier a été mis sur l'identification de différents états et sous-ensembles de macrophages dans de nombreux systèmes d'organes différents et leurs différents rôles dans les blessures et la réparation. Les macrophages sont cruciaux pour la régénération des membres chez la salamandre [83] et la régénération de la nageoire caudale chez le poisson zèbre [84] (figure 3). De plus, les macrophages interagissent intimement avec leur environnement en intégrant des signaux d'agents pathogènes envahisseurs, de bactéries commensales, ainsi que des fonctions spécifiques aux tissus, rendant les macrophages extrêmement bien adaptés à leur environnement local et acquérant ainsi des fonctions spécifiques aux organes [85, 86]. Les populations de macrophages qui se trouvent dans les nombreux tissus différents du corps sont appelées macrophages « résidents dans les tissus » et sont en grande partie dérivées du sac vitellin au cours de l'embryogenèse (examiné dans [87]). En tant que cellules à longue durée de vie, les macrophages résidant dans les tissus sont particulièrement importants, en raison de leur témoignage et de leur « mémorisation » des événements passés et présents dans le tissu, ce qui joue un rôle important dans leur plasticité. De plus, il a été montré que ces macrophages sont capables de réajuster leurs comportements, probablement par des modifications épigénétiques [88,89]. Par conséquent, les macrophages résidant dans les tissus sont essentiels au maintien de l'homéostasie tissulaire.

Figure 3. Des modèles animaux de régénération ont fourni des preuves de l'interaction entre les macrophages et les cellules sénescentes au cours de la régénération tissulaire. L'induction de la sénescence cellulaire conduit à l'initiation du phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP) pendant la régénération des membres de la salamandre, la régénération des nageoires de poisson zèbre et la régénération de l'utérus post-partum. En l'absence de macrophages, les cellules sénescentes du membre de salamandre en régénération ne sont pas éliminées, ce qui est une cause possible d'altération de la régénération (flèche grise en pointillés) [48]. L'élimination des cellules sénescentes ou des macrophages pendant la régénération du poisson zèbre a un effet délétère sur la régénération, supposé être le résultat d'une modification de l'équilibre étroitement régulé de la sénescence cellulaire (flèches grises en pointillés) [125]. L'utérus des mammifères subit un important remodelage post-partum où les cellules sénescentes sont normalement éliminées par les macrophages. En l'absence de macrophages, les cellules sénescentes s'accumulent dans l'utérus [126], entraînant vraisemblablement une régénération et une fonction dérégulées (flèche grise en pointillés). Créé avec Biorender.com.

En réponse à une lésion tissulaire, l'inflammation entraîne un afflux initial de neutrophiles, accompagné de macrophages dérivés des monocytes, qui éliminent les débris cellulaires et coordonnent les processus cellulaires pour initier la réparation tissulaire. Il est important de noter que ce processus conduit à une dilution globale des macrophages résidant dans les tissus dans le pool de macrophages, qui est encore exacerbée par la prolifération des macrophages infiltrants, qui adaptent leur fonction aux signaux environnants dans le microenvironnement local. Une série d'études ont ainsi identifié les rôles spécialisés des monocytes et des macrophages et le moment de leur activation comme critiques dans les différentes étapes de la réparation, de la régénération et du remodelage des tissus [52,54].

3.1. Phénotypes des macrophages

Dans le passé, les macrophages ont été largement séparés en deux catégories : M1 (classiquement activé) et M2 (alternativement activé), en fonction de leurs fonctions inflammatoires et anti-inflammatoires/réparatrices, respectivement. De nos jours, la classification binaire M1/M2 est généralement considérée comme une simplification excessive de la grande variété de populations de macrophages qui existent in vivo, et à ce jour ont été subdivisés en fonction de leurs profils d'expression génique [90,91]. Néanmoins, les macrophages pro-inflammatoires sont généralement associés à l'expression de niveaux élevés de cytokines pro-inflammatoires, à une capacité à médier la résistance aux agents pathogènes, à produire des intermédiaires réactifs d'azote et d'oxygène et à promouvoir Th1 réponses [92]. D'autre part, les macrophages réparateurs sont caractérisés par leur rôle dans le remodelage et la réparation des tissus, la régulation du système immunitaire, les capacités de piégeage et de phagocytose [93], exerçant ainsi principalement des fonctions pro-tumorales et immunorégulatrices (revues dans [94]).

Sans surprise, il a été démontré que la présence de macrophages pro-inflammatoires soutient des réponses inflammatoires endommageant les tissus, et la présence de ces cellules a été associée à une variété de maladies inflammatoires et fibrotiques. Le rôle des macrophages pro-inflammatoires a été particulièrement bien étudié dans des modèles de lésion de la moelle épinière, où il a été démontré que les macrophages s'accumulent facilement sur le site de la lésion. Dans ces modèles, l'activation et la polarisation des macrophages, en fonction des changements dans le microenvironnement, a montré que le recrutement soutenu de macrophages pro-inflammatoires facilite le dépérissement axonal et peut considérablement retarder la réponse régénérative [95], et leur mort in situ contribue en outre aux lésions tissulaires [96]. De plus, la présence d'inhibiteurs de croissance axonale est significativement plus élevée dans les macrophages pro-anti-inflammatoires, suggérant que ces cellules peuvent activement contribuer à supprimer la régénération après une lésion de la moelle épinière [97]. De plus, des études dans le foie ont également impliqué les macrophages inflammatoires dans l'aggravation des lésions, où une augmentation des macrophages inflammatoires est observée dans les zones de nécrose hépatique [98,99]. Ceci a également été observé lors d'une insuffisance rénale aiguë où l'inhibition des macrophages précoces pro-inflammatoires améliore la fonction rénale [100] (figure 2). Cependant, il est important de noter que les macrophages pro-inflammatoires peuvent également contribuer aux processus qui conduisent à la récupération. Cela a été observé dans des modèles de lésions musculaires squelettiques, où l'inhibition de l'accumulation de monocytes/macrophages altère la régénération musculaire [63,64], et la régénération cardiaque, où la déplétion des macrophages entraîne des altérations de l'infiltration et de la néovascularisation des myofibroblastes, et la dilatation ventriculaire et la mortalité subséquentes [ 65] (figure 2). Ainsi, un équilibre fin entre les macrophages pro/anti-inflammatoires est probablement nécessaire pour une réparation optimale après une blessure.

3.2. Études de déplétion et de reconstitution des macrophages

Peut-être sans surprise, l'épuisement complet des macrophages s'est également avéré préjudiciable à la réparation des tissus. Des études de déplétion dans des modèles de lésions tissulaires dans le foie ont montré que les souris appauvries en macrophages ne parviennent pas à exercer une réponse cytokinique complète, ce qui a par la suite compromis la régénération du foie [52]. Cela est probablement dû à la perte de macrophages pro-régénératifs anti-inflammatoires qui jouent un rôle essentiel dans la promotion de la réparation tissulaire. Ces populations de macrophages ont été partiellement définies par leur production de la cytokine anti-inflammatoire IL-10, qui fonctionne comme un important médiateur anti-inflammatoire essentiel au maintien de l'activité anti-inflammatoire [101]. Fait intéressant, dans un modèle de maladie intestinale inflammatoire à début précoce, la perte du récepteur IL-10 (IL-10R) a entraîné le développement spontané de la colite [102], indiquant que la signalisation IL-10R dans les macrophages intestinaux est un facteur important pour contrôler l'inflammation intestinale. De plus, alors que la cicatrisation cutanée des plaies est accélérée chez les souris déficientes en IL-10, résultat attribué à une réépithélialisation et à une contraction accélérées de la plaie, l'infiltration des macrophages était significativement élevée [103], impliquant davantage la signalisation de l'IL-10 dans l'inflammation.

De plus, un article récent de Podaru et al. [104] ont montré que la transplantation de « macrophages réparateurs » fonctionnels, acquis à partir de cellules mononucléées de la moelle osseuse, dans un modèle d'infarctus du myocarde de souris, entraînait une amélioration significative de la récupération fonctionnelle. Ici, les auteurs ont découvert que la transplantation des macrophages réparateurs améliorait la réparation du tissu myocardique, en favorisant la formation du système vasculaire et en réduisant l'hypertrophie des cardiomyocytes et la fibrose interstitielle. Il est intéressant de noter que la transplantation de ces macrophages réparateurs s'est également avérée augmenter le nombre de leurs homologues dérivés de l'hôte, ce qui était en partie médié par le TGF.?? sécrétion [104]. De plus, suite à la mort des hépatocytes lors d'une lésion hépatique, l'engloutissement des débris par les macrophages conduit à l'induction de Wnt3a, qui conduit ensuite à une signalisation canonique de WNT dans les cellules progénitrices hépatiques voisines, facilitant leur différenciation en hépatocytes et contribuant ainsi à la réponse régénérative [105]. Ainsi, la signalisation des cytokines à médiation cellulaire inflammatoire joue un rôle essentiel dans la régénération et la résolution des tissus.

Il a récemment été démontré que de petites vésicules extracellulaires (sEV) dérivées de monocytes M2 dérivés de la moelle osseuse (BMDM) peuvent atténuer les lésions de la moelle épinière (SCI). Les sEV assurent la médiation de la signalisation paracrine et sont importants pour réguler la fonction cellulaire [106]. Ici, les sEV des BMDM M2 se sont avérés protéger les neurones chez les souris SCI, en inhibant la voie mTOR et en améliorant la capacité d'autophagie des neurones, réduisant ainsi l'apoptose in vitro et in vivo. Cela s'est avéré être dû au transfert du microARN miR-421-3p, qui régule la voie mTOR à l'intérieur des M2 BMDM-sEV [107]. Cette étude a montré pour la première fois que les BMDM dérivés de M2 ​​sont importants pour protéger les neurones et faciliter la récupération après une SCI, tout en soulignant que cela se produit via le transfert de sEV. De plus, cette étude élucide ainsi davantage les rôles bénéfiques des macrophages M2 lors d'une blessure et indique un mécanisme par lequel ils exercent leur fonction protectrice/réparatrice.

Fait intéressant, il a été démontré que de tels macrophages anti-inflammatoires favorisent non seulement la réparation tissulaire, mais antagonisent également la fonction des macrophages pro-inflammatoires et luttent contre leurs capacités pro-fibrotiques [108,109]. Ainsi, l'interaction/coopération des macrophages avec divers types de cellules, y compris celles impliquées dans la phase initiale de l'inflammation, est d'une importance vitale. Il a été récemment montré que les neutrophiles ont également une fonction cruciale dans la réparation hépatique, en favorisant la conversion phénotypique des monocytes/macrophages pro-inflammatoires Ly6C hi CX3CR1 lo en macrophages pro-réparateurs Lyc6 lo CX3CR1 hi. De plus, cette conversion s'est avérée dépendante de l'expression des espèces réactives de l'oxygène (ROS) des neutrophiles [110,111]. Curieusement, cette étude a démontré la coopération entre les neutrophiles et les macrophages et l'importance de leur interaction dans la résolution de l'inflammation et la réparation tissulaire [111]. Cela confirme l'accumulation de preuves que les macrophages dérivés des monocytes peuvent subir une transition à la fois phénotypique et fonctionnelle afin de favoriser la régénération et la cicatrisation des tissus [112,113].

Enfin, l'activité des macrophages au cours des différentes phases de lésion tissulaire est importante pour la réparation tissulaire. En appauvrissant sélectivement les populations de macrophages Duffield et al. [52] ont montré que les macrophages ont des rôles distincts et opposés lors de la blessure et de la réparation. Plus précisément, dans un modèle murin de lésion hépatique réversible induite par Ccl4, l'épuisement des macrophages au cours de la fibrose avancée a entraîné une réduction des cicatrices. Cependant, si les macrophages étaient épuisés pendant la période de réparation, cela entraînait l'échec de la dégradation de la matrice et une activation persistante de la réponse fibrotique. Surtout, cela a montré que les macrophages effectuent à la fois des tâches induisant des blessures et favorisant la réparation (figure 2), et que des sous-populations fonctionnellement distinctes de macrophages existent dans le même tissu qui jouent un rôle important dans différentes phases de blessure/récupération [52]. De plus, l'épuisement des macrophages dans les premiers stades de la réparation des plaies cutanées a retardé la réépithélialisation, entraînant une réduction de la formation de cicatrices, tandis que l'épuisement au milieu de la phase de formation de nouveaux tissus a entraîné une altération de la fermeture de la plaie. Surtout, l'épuisement dans les derniers stades de la réparation n'a eu aucun effet sur la réponse de réparation globale, suggérant que les macrophages jouent des fonctions différentes et distinctes pendant les phases de réparation cutanée [54,114] (figure 2). En fin de compte, des études telles que celles-ci démontrent que les macrophages exercent des fonctions différentes et distinctes à différentes étapes des processus de réparation ou de régénération, une découverte cruciale si nous voulons manipuler thérapeutiquement la fonction des macrophages à l'avenir pour améliorer la régénération des organes.

4. L'interaction entre les cellules sénescentes et les macrophages dans la régénération et la réparation des tissus

La sénescence est maintenant connue pour jouer un rôle important dans de nombreux tissus différents au cours du développement embryonnaire murin [23,24]. Cela comprend les tubules mésonéphrotiques pendant l'involution du mésonéphros (développement des reins et des testicules), le sac endolymphatique de l'oreille interne, la crête ectodermique apicale des membres, les réseaux interdigitaux en régression des mains et des pieds, et la fermeture du système nerveux tuyaux [23]. En effet, il existe des preuves que les cellules sénescentes dans le développement murin sont entourées de macrophages aux jours E13,5–14,5, et que l'infiltration des macrophages conduit à la clairance des cellules sénescentes et à la promotion du remodelage tissulaire [23,97]. Il est important de noter que les processus observés au cours du développement nous fournissent un aperçu unique des mécanismes qui entraînent la régénération et la réparation après une blessure à l'âge adulte, et servent de point de départ pour la manipulation de tels processus. in vivo.

4.1. Surveillance des cellules sénescentes par les macrophages

Le rôle des macrophages dans l'élimination des cellules sénescentes est connu depuis plus d'une décennie [115]. En raison de la libération substantielle de cytokines et de chimiokines par les cellules sénescentes via le SASP, il n'est pas surprenant qu'un nombre croissant d'études semblent soutenir un mécanisme de surveillance dépendant des macrophages qui fonctionne à la fois dans les tissus normaux et en régénération. En effet, il semble logique que le nombre de cellules sénescentes doive être étroitement surveillé pour maintenir l'homéostasie tissulaire et atténuer et/ou prévenir les impacts négatifs de l'accumulation de cellules sénescentes. La première preuve de l'implication du système immunitaire dans la surveillance des cellules sénescentes est venue en 2007 de Xue et al. [116], qui ont révélé que la réactivation de p53 dans les tumeurs déficientes en p53 conduisait à une régression tumorale complète. Ceci s'est avéré être médié par la régulation positive des cytokines inflammatoires et l'activation de la réponse immunitaire innée [116]. Après cela, le rôle des cellules immunitaires, y compris les macrophages, s'est avéré important dans l'élimination des cellules sénescentes dans les modèles de lésions hépatiques, ainsi que pour prévenir la fibrose préjudiciable excessive et résoudre la fibrose hépatique [117]. De plus, il a été démontré que les cellules étoilées hépatiques sénescentes sécrètent une SASP qui attire les macrophages [118]. En 2013, Lujambio et al. ont montré que les cellules étoilées exprimant p53 libèrent de l'IFN-γ et de l'IL-6, qui favorisent la polarisation des macrophages résidents de Kupffer et des macrophages infiltrés vers un état M1 inhibiteur de tumeur, capable de cibler les cellules sénescentes en culture. Cependant, dans les cellules étoilées sénescentes dépourvues de p53, de l'IL-4 a été produite, provoquant une polarisation des macrophages vers le phénotype M2 pro-survie [119]. Ainsi, ces preuves suggèrent que les cellules sénescentes peuvent provoquer des changements phénotypiques dans les macrophages qui peuvent affecter leur fonctionnalité. Il est intéressant de noter que les cellules souches mésenchymateuses (CSM) semblent également jouer un rôle régulateur dans le passage des macrophages locaux d'un phénotype pro-inflammatoire à un phénotype réparateur tissulaire [120,121], et en l'absence de macrophages, les nouveau-nés perdent leur capacité à régénérer leur myocarde après myocarde. infarctus [122].

Pour ajouter à cela, les cellules sénescentes sont également capables de déclencher une réponse immunitaire adaptative lorsqu'elles sont éliminées par les cellules T CD4+ et les monocytes/macrophages. Cela a été démontré dans le foie, où les hépatocytes sénescents pré-malignes subissent une clairance par les cellules T CD4+, qui nécessitent la présence de monocytes/macrophages, soulignant l'importance de la diaphonie des cellules immunitaires dans la clairance des cellules sénescentes [123]. De plus, dans un modèle de cancer du foie, la surveillance des cellules sénescentes s'est avérée nécessiter le recrutement et la maturation des cellules myéloïdes CCR2+, tandis que l'ablation de CCR2 provoquait l'excroissance des carcinomes hépatocellulaires [124].

4.2. Cellules sénescentes et interactions macrophages pendant la régénération

Pour approfondir ces interactions, en 2015, Yun et al. [48] ​​ont montré que les macrophages étaient essentiels à la clairance des cellules sénescentes, fournissant la première preuve que les mécanismes de surveillance de la sénescence fonctionnent pendant la régénération normale. Ici, les auteurs ont démontré que pendant la régénération des membres de la salamandre, il y avait une induction significative de la sénescence cellulaire, indiquant son importance en tant que mécanisme de régénération dans les tissus normaux en régénération. De plus, Yun et al. ont également rapporté qu'une forte signature SASP dans les blastèmes coïncidait avec un fort pic d'induction de cellules sénescentes (figure 3), indiquant que celles-ci pourraient avoir des effets paracrines sur la régénération et la chimio-attraction des macrophages [48]. Surtout, les macrophages et les cellules sénescentes se trouvent à proximité les uns des autres dans les membres en régénération. En revanche, la délétion des macrophages médiée par le clodronate entraîne la persistance des cellules sénescentes lors de la régénération des membres [48]. À l'appui de cela, des rapports dans d'autres organismes modèles tels que le poisson zèbre ont démontré les impacts négatifs de l'ablation des macrophages pendant la régénération des nageoires du poisson zèbre [84]. Cela a été étudié plus en détail dans une étude de 2020 par Da Silva-Álvarez et al., qui a montré qu'à la suite d'une blessure chez le poisson zèbre, des cellules sénescentes étaient présentes au site de la blessure, et que leur élimination nuisait à la régénération [125] (figure 3). De plus, les cellules sénescentes qui s'accumulent dans l'utérus post-partum des mammifères sont efficacement éliminées par les macrophages après la naissance, tandis que l'épuisement des macrophages conduit à une accumulation anormale de cellules sénescentes [126] (figure 2).

Il existe donc des preuves convaincantes du rôle des cellules sénescentes et de leur interaction avec les macrophages dans les lésions et la réparation des tissus. La SASP favorise la prolifération des macrophages [127], tandis que les macrophages P16INK4a+ s'accumulent avec l'âge et exacerbent la SASP [128]. Le facteur de transcription GATA4 est stabilisé pendant la sénescence cellulaire, qui à son tour active la NF??B pour faciliter le SASP [129] (figure 4). Cependant, à ce jour, des questions subsistent concernant les mécanismes par lesquels les cellules sénescentes interagissent avec le système immunitaire, y compris les macrophages, et comment cela déclenche ou empêche une réponse réparatrice. Il a été précédemment montré que les cellules sénescentes expriment les ligands NKG2D MICA et ULBP2 à leur surface cellulaire, permettant leur reconnaissance et leur élimination par les cellules tueuses naturelles (NK). De plus, l'expression de ces ligands s'est avérée être régulée par la réponse aux dommages de l'ADN et la voie de signalisation ERK à la suite d'une blessure [131] (figure 4).

Figure 4. Les cellules sénescentes et les macrophages communiquent via des signaux bidirectionnels complexes pendant le remodelage, la réparation, la régénération et la tumorigenèse des tissus. Les cellules sénescentes sont détectées grâce à la surveillance immunitaire par les cellules tueuses naturelles (NK), médiées par le contact cellule-cellule, le transfert de protéines, la polymérisation de l'actine et les ponts cytoplasmiques, ce qui facilite finalement la reconnaissance par les cellules NK et les cellules T [130]. Les cellules sénescentes expriment les ligands MICA et ULBP2 à leur surface cellulaire en réponse aux dommages à l'ADN et à la signalisation ERK, ce qui facilite leur clairance par les cellules NK [131]. De plus, les cellules sénescentes expriment souvent le MHCII et la vimentine qui permettent une reconnaissance par les cellules T et les macrophages, respectivement [123,132,133]. À l'inverse, les cellules sénescentes peuvent échapper à la détection en exprimant le signal « ne me mange pas » CD47, qui altère la phagocytose par les macrophages en se liant au récepteur inhibiteur SIRP?? [111] et GATA4 est stabilisé pendant la sénescence cellulaire, qui à son tour active la NF??B pour faciliter le SASP [129]. Les macrophages existent en tant que cellules résidentes dans les tissus ou sont dérivés de monocytes véhiculés par le sang et peuvent être polarisés vers un état pro-inflammatoire ou pro-réparateur. Expression de p16 Ink4a et Sa??Gal dans les macrophages a été impliqué dans un rôle de polarisation, plutôt que comme conséquence de la sénescence paracrine [128,134,135]. Le CCR2 exprimé par les macrophages est essentiel pour la surveillance des cellules sénescentes et la clairance par les cellules T et les macrophages infiltrants [124]. Dans des conditions physiologiques normales, les cellules étoilées p53+ libèrent les cytokines pro-inflammatoires, IFN-γ et IL-6, qui favorisent la polarisation des cellules de Kupffer résidentes et des macrophages infiltrants vers un état pro-inflammatoire, qui peut cibler les cellules sénescentes. Inversement, dans les cellules étoilées sénescentes dépourvues de p53, de l'IL-4 est produite, entraînant une polarisation des macrophages vers le phénotype pro-survie [119]. Le phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP) conduit à des cytokines inflammatoires élevées, à l'activation de la réponse immunitaire et à la clairance des cellules sénescentes. En plus de ce rôle classique, SASP conduit également à un remodelage extracellulaire (ECM) qui contribue à un recrutement cellulaire altéré et à un accès altéré des cellules immunitaires aux cellules sénescentes [136]. La molécule du CMH HLA-E, qui est exprimée par les cellules sénescentes et induite par l'IL-6, interagit avec le récepteur inhibiteur NKG2A, exprimé par les cellules NK et les cellules T, pour échapper à la surveillance, et le blocage de cette interaction améliore les réponses immunitaires contre les cellules sénescentes [137], d'une manière selon laquelle une inflammation soutenue contribue également à la persistance des cellules sénescentes. Créé avec Biorender.com.

4.3. Cellules sénescentes et interactions des macrophages avec le vieillissement

Une autre question en suspens est de savoir ce qui permet aux cellules sénescentes de s'accumuler pendant le vieillissement/les blessures et comment les cellules sénescentes parviennent à échapper à l'élimination par le système immunitaire. Les progrès dans la réponse à cette question ont montré que les fibroblastes dermiques sénescents peuvent échapper à la clairance du système immunitaire en exprimant la molécule non classique du CMH HLA-E. HLA-E fonctionne en interagissant avec les récepteurs inhibiteurs NKG2, exprimés par les cellules NK et les cellules T CD8+, pour inhiber les réponses immunitaires contre les cellules sénescentes (figure 4). Les auteurs ont découvert que le blocage de l'interaction entre HLA-E et le récepteur NKG2A stimulait les réponses immunitaires contre les cellules sénescentes in vitro. Fait intéressant, ils ont découvert que la cytokine IL-6 liée à la SASP induisait l'expression de HLA-E dans les cellules non sénescentes de manière paracrine [137]. La régulation à la hausse de l'expression de HLA-E par l'IL-6 suggère donc qu'une inflammation soutenue peut également contribuer à la persistance des cellules sénescentes dans les tissus, contribuant davantage à la pathogenèse des blessures ou des maladies liées à l'âge. Ceci est corroboré par le fait que l'IL-6 a été bien caractérisée dans la sénescence [138] et se trouve dans le sérum de patients âgés, ainsi que dans divers modèles de lésions [139, 140]. De plus, comme le notent les auteurs, l'expansion des cellules T CD8+ qui sont NKG2C+, une autre isoforme des récepteurs inhibiteurs NKG2, avec l'âge peut expliquer pourquoi le système immunitaire est moins efficace pour éliminer les cellules sénescentes chez les personnes âgées. Il serait donc intéressant de déterminer si l'abondance/le rôle des lymphocytes T CD8+ NKG2C+ est altéré lors d'une lésion aiguë et/ou chronique.

Un autre élément important pour la régénération tissulaire est la matrice extracellulaire (ECM) et sa diaphonie avec les cellules du microenvironnement environnant. Il est intéressant de noter que le SASP soluble est connu pour induire un remodelage et un raidissement de la MEC, ce qui a déjà été démontré qu'il modifie le recrutement des cellules immunitaires au cours du vieillissement [136]. En fait, les altérations de la MEC résultant de changements dans la rigidité de la matrice altèrent l'accès des cellules immunitaires aux tissus enrichis en sénescence [136]. De plus, les cellules stromales telles que les fibroblastes sont responsables de la régulation de la structure tissulaire par le dépôt de la MEC, ainsi que du soutien de l'homéostasie par la sécrétion de cytokines, de chimiokines, de facteurs de croissance et d'autres protéines de signalisation clés [136] (figure 4). Nous avons discuté précédemment de l'importance du SASP dans la libération de facteurs solubles qui influencent le microenvironnement tissulaire environnant et maintiennent l'homéostasie tissulaire. Il a été rapporté qu'il existe une importante diaphonie entre les populations stromales associées à la sénescence qui sont connues pour s'accumuler au cours du vieillissement et un phénotype immunosuppresseur.

4.4. Les parallèles entre les macrophages et les cellules sénescentes

En plus du rôle phagocytaire bien documenté des macrophages, il a été récemment montré, pour la première fois, que les cellules sénescentes induites par la chimiothérapie (CISC) sont capables d'engloutir à la fois des cellules sénescentes voisines ou des cellules tumorales non sénescentes dans un macrophage-like. mode. Il est important de noter que ce comportement a été noté après un traitement de chimiothérapie. Cependant, ce comportement est également déclenché par l'administration de nutline, qui active p53 sans provoquer de stress génotoxique [141].Cette découverte fascinante que les cellules sénescentes, dans le bon environnement, peuvent acquérir un phénotype phagocytaire, suggère un avantage potentiel de survie.

Cette capacité nouvellement découverte des cellules sénescentes met en lumière des parallèles avec les macrophages, dans lesquels les macrophages et les cellules sénescentes sécrètent des facteurs qui provoquent le remodelage de la matrice et l'immunomodulation [142,143], et expriment des marqueurs métaboliques, tels que CD38 [144]. En effet, il a été suggéré que le cannibalisme par les cellules cancéreuses du sein joue un rôle dans l'induction de la sénescence [141] ainsi, il sera important d'étudier le rôle du cannibalisme des cellules sénescentes dans une gamme de contextes différents, y compris le développement, le vieillissement et la régénération /réparation. En particulier, il sera intéressant de déterminer le rôle de telles cellules dans l'accumulation de cellules sénescentes, et si le cannibalisme peut jouer un rôle dans la clairance cellulaire suite à une blessure. En outre, il sera essentiel de déterminer quels types de cellules ces cellules cannibales engloutissent préférentiellement, et s'il existe certaines caractéristiques qui conduisent à leur engloutissement, afin de déterminer si, si de telles cellules existent en dehors du contexte du cancer, elles sont bénéfiques ou néfastes. au processus de régénération et de réparation.

4.5. Le vieillissement du système immunitaire et l'immunosénescence

À mesure que le corps vieillit, le système immunitaire inné décline progressivement, un phénomène maintenant appelé immunosénescence [145], entraînant une diminution de la fonction des cellules immunitaires effectrices et une diminution spectaculaire du taux de renouvellement des tissus sains [146]. En conséquence, le microenvironnement tissulaire âgé accumule des cellules sénescentes, telles que des fibroblastes associés à SASP, et gagne l'infiltration d'infiltrats immunitaires tels que les cellules suppressives dérivées des myéloïdes (MDSC) immunosuppressives et les cellules régulatrices T. Les MDSC sont une population hétérogène de cellules d'origine myéloïde qui répriment les cellules T via la sécrétion d'arginase 1, TGF?? et les espèces réactives de l'oxygène (ROS), tandis que les cellules régulatrices T ont un rôle dans la régulation ou la suppression d'autres cellules du système immunitaire (examiné dans [147]). Il a été suggéré que cette altération du microenvironnement tissulaire pourrait favoriser le développement de conditions pathologiques telles que le cancer et permettre l'expansion des cellules cancéreuses sans être ralentie par le système immunitaire. En effet, en cas de lésion chronique, il est certainement possible que cette clémence du système immunitaire, ou une surveillance immunitaire altérée, puisse également avoir des effets similaires, par exemple, en permettant l'accumulation de cellules sénescentes. De plus, l'immunosénescence des cellules T effectrices, des cellules NK, des macrophages et des cellules dendritiques est connue pour entraîner une diminution spectaculaire de leurs activités cytotoxiques et de leur infiltration dans un microenvironnement âgé favorisant la tumeur [148]. Ceci a été soutenu par l'observation qu'il existe des augmentations systémiques des macrophages M2 immunosuppresseurs et des neutrophiles N2 chez les personnes âgées (revue dans [149]), ce qui peut contribuer à un phénotype immunosuppresseur. Cela a été montré dans un modèle d'induction de la sénescence, utilisant les fibroblastes de souris FASST (accélération de la tumorigenèse stromale), où les auteurs ont observé une accumulation de cellules sénescentes, ainsi qu'un nombre accru de MDSC et de cellules T régulatrices, ce qui n'était pas le cas. observé dans un microenvironnement tissulaire plus jeune. De plus, cette augmentation du nombre de MDSC et de cellules T reg chez les souris saines a été trouvée adjacente aux populations de cellules sénescentes et s'est avérée principalement due à la sécrétion d'IL-6 [148]. De plus, la suppression de la perforine (Prf1), composante essentielle de la surveillance immunitaire des cellules sénescentes, conduit à l'accumulation de cellules sénescentes dans le foie [150] et à une augmentation générale de l'accumulation avec l'âge avancé, entraînant une inflammation chronique, une fibrose et des lésions tissulaires [117]. Ainsi, ce processus de SASP transitoire et de clairance des cellules sénescentes chez les souris jeunes par rapport aux souris âgées au cours du processus naturel de vieillissement montre des similitudes très claires avec la survenue du programme de sénescence et le cycle de clairance/accumulation de cellules sénescentes dans les lésions aiguës et chroniques, respectivement. .

Un mécanisme bien caractérisé par lequel les cellules sénescentes et apoptotiques sont régulées par les macrophages est via leurs signaux « mangez-moi ». Cependant, les cellules sénescentes expriment souvent le signal « ne me mangez pas » CD47, une protéine de surface cellulaire médiée par la régulation positive de la NF??B, qui altère la phagocytose par les macrophages en se liant à la protéine régulatrice du signal du récepteur inhibiteur alpha (SIRP??) trouvé à la surface cellulaire des macrophages. Inversement, les cellules sénescentes semblent également réguler positivement leur expression des molécules du CMH de classe II à leur surface cellulaire, ce qui facilite leur reconnaissance par les cellules T CD4+ [123, 132]. De plus, il a été récemment identifié que les cellules sénescentes expriment également une forme oxydée de vimentine à leur surface cellulaire, qui est finalement libérée dans la circulation sanguine, suggérant que les protéines oxydées sont capables d'être reconnues par le système immunitaire inné humoral. Cela suggère que ces protéines font partie d'un mécanisme de surveillance de la sénescence en agissant comme des signaux « me mange-moi », et ce processus peut être altéré avec l'âge [133]. La vimentine modifiée est déjà connue pour être exprimée à la surface des cellules immunitaires, y compris les neutrophiles apoptotiques [151-153] et les cellules T [154], ce qui conduit finalement à l'élimination par les macrophages [155]. De plus, il a été découvert que les protéines radio-induites présentes à la surface des cellules apoptotiques peuvent interagir avec la vimentine présente à la surface des phagocytes voisins, conduisant à leur élimination par les macrophages [155]. Comprendre les mécanismes qui régulent la capacité phagocytaire des macrophages et la clairance subséquente des cellules sénescentes sera d'une importance vitale pour développer de futures approches thérapeutiques pour aider à la régénération et améliorer la durée de vie.

Les cellules sénescentes sont également capables de communiquer avec les cellules voisines par transfert direct de protéines. En 2015, il a été montré par Biran et al. [130] que les protéines étaient transférées aux cellules NK et T, et que ce processus était facilité par la surveillance immunitaire des cellules sénescentes par les cellules NK, entraînant leur activation et une cytotoxicité accrue. Le transfert de protéines dépendait strictement du contact cellule-cellule et de la polymérisation de l'actine régulée par CDC42, et partiellement médié par des ponts cytoplasmiques. Cela soulève la possibilité que les cellules sénescentes puissent utiliser le transfert de protéines intracellulaires pour induire la sénescence dans les cellules voisines ou peut-être même pour favoriser la survie. De plus, il est possible que ce processus soit important pour la régénération, en permettant le transfert cellule-cellule de médiateurs moléculaires entre les cellules sénescentes et régénératives ou de soutien. En effet, les auteurs ont constaté que par rapport aux cellules normales, les cellules sénescentes utilisent préférentiellement le transfert intercellulaire de protéines (TPI) pour réguler leur propre auto-élimination par les cellules immunitaires et communiquer avec les cellules épithéliales. Pour étayer cela, une variété d'autres études ont montré que l'IPT est utilisé à la fois pour initier et moduler les réponses immunitaires qui, en fin de compte, soutiennent la survie cellulaire [156-158]. Une enquête plus approfondie est nécessaire pour déterminer de manière exhaustive le transfert de matériel entre les macrophages et d'autres cellules immunitaires pendant la sénescence et la régénération/réparation. La publication récente d'une base de données protéomique des protéines solubles et des facteurs SASP de la cargaison exosomale conduira sans aucun doute à une compréhension plus approfondie de la communication cellulaire et de la sénescence [14].

Alors que l'on en sait davantage sur le rôle des cellules sénescentes et des macrophages ou du système immunitaire dans la régénération et la réparation, de nombreuses questions restent ouvertes. Par exemple, on ne sait toujours pas si les macrophages eux-mêmes deviennent sénescents dans le contexte d'une blessure et si cela peut contribuer à l'accumulation de cellules sénescentes. En effet, alors que les dommages au système immunitaire entraînent l'incapacité à éliminer les cellules sénescentes, contribuant à leur persistance dans les tissus, une telle défaillance immunitaire peut être en partie due à l'immunosénescence, entraînant un dysfonctionnement des cellules immunitaires.. salle et al. [128] ont précédemment rapporté l'observation de l'expression de p16 INK4a et de Sa-β-Gal dans les macrophages suggérant que les cellules sénescentes pourraient propager la sénescence aux cellules immunitaires. Cependant, les auteurs ont rapporté plus tard que l'expression de ces marqueurs n'était pas due à une propagation de la sénescence, mais plutôt acquise dans le cadre d'une réponse physiologique à des stimuli immunitaires [134]. Ceci est cohérent avec les rapports selon lesquels p16 INK4a est impliqué dans la polarisation des macrophages [135]. Ainsi, que les cellules immunitaires deviennent sénescentes lors d'une blessure ou d'une maladie nécessite une enquête plus approfondie. Cependant, il a été rapporté que les cellules immunitaires subissent un déclin progressif de leur fonction, appelé immunosénescence, qui contribue à l'accumulation de cellules sénescentes [159, 160]. De plus, si les macrophages deviennent sénescents, conservent-ils toujours leur capacité à éliminer les cellules cibles, y compris les autres cellules sénescentes ? Si tel est le cas, il est probable que les macrophages contribuent au processus d'« inflammaging », y compris l'immunosénescence, surtout s'il s'avère que les macrophages sénescents favorisent un environnement pro-inflammatoire. En outre, la compréhension d'autres mécanismes par lesquels les macrophages sont endommagés et qui provoquent des changements dans leur fonction et/ou leur phénotype lors d'une blessure sera également importante lors de l'examen d'approches thérapeutiques.

4.6. Accumulation de cellules sénescentes et pathologie

D'autres questions en suspens incluent s'il existe un «point de basculement» auquel les cellules sénescentes doivent s'accumuler avant que le tissu ne devienne dysfonctionnel, et si un processus similaire se produit au point où les macrophages sont incapables d'éliminer les cellules sénescentes. Comme mentionné précédemment, les mécanismes spécifiques par lesquels les macrophages interagissent avec les cellules sénescentes restent à élucider. Comprendre les mécanismes moléculaires qui régissent ces interactions et qui régulent la fonction des macrophages sera essentiel pour la progression des thérapies et la compréhension des maladies chroniques. Conformément à l'interaction des cellules sénescentes avec les cellules T CD4+ pour échapper à la surveillance immunitaire, il serait bénéfique de caractériser davantage si des mécanismes similaires existent entre les macrophages et les cellules sénescentes. Enfin, alors que diverses études ont indiqué individuellement le rôle des différentes composantes du programme de sénescence dans la réponse régénérative, une étude approfondie reliant ces processus reste à entreprendre. Alors que le SASP transitoire est bénéfique pour la régénération et que la signalisation SASP soutenue favorise l'accumulation de cellules sénescentes, une étude complète des « ondes » du SASP dans la réparation/régénération, le point auquel ce processus devient préjudiciable et les mécanismes exacts qui régissent cette réponse et comment ils interagissent les uns avec les autres fait encore défaut.

5. Manipulation thérapeutique des macrophages pour la régénération/réparation des tissus

Comme indiqué dans les sections précédentes, le rôle des macrophages dans le maintien de l'homéostasie tissulaire, l'élimination des cellules sénescentes et la promotion de la régénération commence à être mieux établi. En raison du rôle inné des macrophages dans ces processus, une idée émergente de traitement des maladies/pathologies liées à l'âge liées à l'accumulation de cellules sénescentes relève du domaine de la manipulation de la fonction des macrophages. De telles idées incluent le traitement de la maladie d'Alzheimer [161], de l'infarctus du myocarde [162], du cancer [163] et des maladies inflammatoires [164] telles que la polyarthrite rhumatoïde, avec une thérapie par macrophages.

5.1. Approches d'ingénierie des macrophages

Une méthode pour parvenir à une approche thérapeutique consiste à concevoir des macrophages pour ignorer les signaux « ne me mangez pas » trouvés à la surface des cellules sénescentes. Comme mentionné précédemment, le CD47-SIRP?? permet aux cellules sénescentes d'éviter leur élimination par le système immunitaire. Par conséquent, le blocage de cet axe peut être un traitement efficace contre l'accumulation de cellules sénescentes lors du vieillissement et des blessures. Des molécules qui ciblent cet axe ont déjà été développées et incluent celles qui ciblent CD47, ainsi que SIRPα spécifiquement, aux côtés d'agents de ciblage bispécifiques. L'utilisation de ces agents a été bien caractérisée dans le cancer, où les anticorps anti-CD47 sont actuellement en essais cliniques [111]. Compte tenu du rôle des macrophages dans le blocage de l'axe CD47-SIRPα, l'ingénierie des macrophages pour cibler CD47 peut être efficace. Par exemple, à l'instar des cellules CAR-T, les récepteurs antigéniques chimériques pour la phagocytose (CAR-P) sont conçus pour phagocyter des cibles spécifiques, et il a été suggéré que l'ingénierie des macrophages pour cibler CD47 pourrait être une thérapie anti-tumorale efficace [111]. En effet, l'utilisation de ces macrophages peut s'avérer efficace dans l'élimination de l'accumulation chronique de cellules sénescentes après une blessure. Cependant, il subsiste des inquiétudes concernant la manipulation de l'axe CD47-SIRPα à des fins thérapeutiques, y compris, mais sans s'y limiter, le consensus selon lequel les interactions CD47-SIRPα démontrées dans les études sur la souris peuvent ne pas se traduire complètement ou aussi efficacement chez l'homme [165] la découverte que le clustering de CD47 peut également influencer l'interaction entre CD47 et SIRPα, et que l'anticorps non bloquant anti-CD47 2D3 augmente le clustering de CD47 [166,167], et les fonctions considérables de CD47 qui sont indépendantes de SIRPα, qui agissent plutôt sur SIRPγ ou Thrombospondine 1 (TSP1), conduisant à des effets potentiels hors cible sur les cellules T [168,169]. Une autre possibilité consiste à augmenter la capacité phagocytaire des macrophages, en augmentant les signaux « mange-moi ». L'expression défectueuse du signal calréticuline « mangez-moi », un ligand requis pour l'activation des récepteurs d'engloutissement sur les cellules phagocytaires, entraîne une résistance cellulaire à l'efférocytose et les cellules apoptotiques ne parviennent pas à être éliminées par les macrophages voisins [170]. Une proportion de cellules âgées et cancéreuses sont susceptibles d'être « marquées » par la calréticuline sécrétée par les macrophages et sont ensuite éliminées des tissus [171]. Ainsi, la surexpression de la calréticuline sur les cellules sénescentes peut fournir un moyen d'augmenter la phagocytose et la clairance du tissu par les macrophages. Une troisième option implique l'utilisation de macrophages allogéniques ou l'administration de macrophages dérivés de cellules souches pluripotentes induites (IPS) provenant de jeunes donneurs [172]. 173], tandis que d'autres ne rapportent aucune différence [174]. De plus, les différences semblent être liées au tissu dont elles sont issues et à leur résidence ou infiltration tissulaire [175]. Ainsi, le ciblage des macrophages peut être une option thérapeutique pour la clairance des cellules sénescentes in vivo.

5.2. Sénolytiques

Une autre façon d'éliminer les cellules sénescentes consiste à utiliser des médicaments qui tuent les cellules sénescentes, appelés sénolytiques. Il a été démontré que l'élimination des cellules sénescentes à l'aide de médicaments sénolytiques, tels que l'ABT-263, qui agissent en ciblant les protéines impliquées dans la voie de l'apoptose (telles que BCL-xL et BCL-2), a réussi à éliminer les cellules sénescentes. in vitro et in vivo [73,176]. En particulier, ABT-263, qui signale via les protéines anti-apoptotiques BCL-xL et BCL-2, s'est avéré efficace pour éliminer les cellules sénescentes dans des modèles murins [73,177] et fait actuellement l'objet d'essais cliniques de phase 1 chez des patients cancéreux [178] . De plus, le dasatinib plus quercétine (DQ), qui cible non seulement les membres de la famille BCL-2, mais aussi les voies anti-apoptotiques liées à HIF-1α, PI3-kinase et p21 [179], s'est avéré efficace pour améliorer la dysfonction physique dans les maladies pulmonaires idiopathiques. patients atteints de fibrose (FPI) [180]. Cependant, il reste des limites à l'utilisation des sénolytiques, en grande partie en raison du manque de spécificité, de biodisponibilité et de leur voie d'administration. En effet, si les macrophages eux-mêmes deviennent sénescents dans le cadre d'une lésion, il peut être nécessaire de combiner les travaux sur les sénolytiques pour inclure ceux qui peuvent cibler les macrophages ainsi que d'autres cellules. Alternativement, une thérapie qui active les réseaux de gènes pour promouvoir un phénotype « plus jeune » dans les macrophages pourrait constituer une option réaliste. Ceci est particulièrement important en raison du rôle essentiel que jouent les macrophages dans la génération d'un environnement permettant la régénération nécessaire à la réparation des tissus.

Comme mentionné précédemment, alors que les sénolytiques se sont avérés efficaces pour tuer les cellules sénescentes, ils conservent une activité à large spectre, en particulier compte tenu de la nature hétérogène du programme de sénescence. En 2020, Cai et al. [181] ont développé un nouveau promédicament nommé SSK1 qui est spécifiquement activé par l'activité de la -galactosidase (β-Gal), considérée comme un marqueur bien documenté des cellules sénescentes. Il a été démontré que le promédicament élimine les cellules sénescentes, rétablit l'inflammation de bas grade et rétablit certaines mesures de fonction. Ce nouveau médicament représente donc une méthode plus sélective de suppression des cellules sénescentes dans un large éventail de types cellulaires et de tissus [181]. En plus de réduire le nombre de cellules sénescentes en général, le promédicament s'est avéré diminuer le nombre de macrophages SA-β-Gal positifs dans les poumons blessés et les foies âgés, ce qui s'accompagnait d'une réduction des cytokines liées à l'inflammation. Cela suggère que l'élimination des macrophages eux-mêmes peut être bénéfique. Ici, il est important de noter l'étude mentionnée précédemment par Hall et al. dans laquelle les auteurs ont rapporté que les macrophages sénescents étaient évidents chez les jeunes souris, entièrement en raison de leur expression des marqueurs p16 INK4a et β-galactosidase [128]. Cependant, l'expression de ces marqueurs a été décrite plus tard comme étant des marqueurs de la polarisation et de la réponse des macrophages [134]. Surtout, cela met en évidence le besoin de meilleures méthodes pour l'identification de la sénescence dans les cellules immunitaires. De plus, étant donné que les cellules sénescentes n'ont pas de marqueur universel spécifique, et en raison de leur nature dynamique, que leurs marqueurs peuvent altérer au fil du temps, la spécificité de tout médicament visant à cibler uniquement les cellules sénescentes est problématique.

5.3. Approches du génie génétique

Comme l'élimination des macrophages eux-mêmes a tendance à entraîner de graves conséquences, une approche alternative consiste à modifier leur expression génique afin d'induire certains phénotypes. Il s'agit de l'expression de certains facteurs de transcription, par exemple IRF5, qui est impliqué dans la polarisation des macrophages vers un phénotype inflammatoire, qui à son tour empêche la cicatrisation et favorise l'inflammation. Ainsi, la manipulation des macrophages pour exprimer des niveaux inférieurs d'IRF5 pourrait être une stratégie prometteuse [182].En outre, la livraison de microARN ou d'autres molécules par des méthodes de livraison telles que les liposomes peut être une méthode prometteuse pour la manipulation génétique digne d'une enquête plus approfondie [183,184].

En ce qui concerne la manipulation génétique, un aspect intéressant de la sénescence qui doit encore être exploré en profondeur est la régulation de l'expression des gènes au niveau épigénétique. Une idée intéressante en médecine régénérative est que les facteurs de pluripotence peuvent être exprimés dans les cellules sénescentes, pour favoriser la ré-entrée dans le cycle cellulaire et modifier les profils d'expression génique. En plus de cela, il y a eu un intérêt pour l'utilisation de facteurs épigénétiques pour promouvoir la reprogrammation, car les cellules sénescentes affichent une configuration répressive de la chromatine, qui est censée réduire de manière stable les gènes favorisant la prolifération, tout en activant également le SASP. En particulier, des modifications d'histones telles que H3K27me3 ont été associées à une régulation positive de la SASP dans les cellules sénescentes [185]. Fait intéressant, dans une étude récente, il a également été montré que l'activation du programme de sénescence conduit au remodelage du paysage épigénétique en recrutant BRD4, un régulateur transcriptionnel et épigénétique, qui active les super-amplificateurs nouvellement activés situés à côté des gènes SASP [186 ]. De plus, BRD4 s'est avéré critique pour la signalisation SASP et paracrine, et dans la surveillance immunitaire de la sénescence. Fait important, cette étude a révélé comment les cellules peuvent activer les gènes immunomodulateurs requis pour l'activation immunitaire paracrine et un programme de surveillance immunitaire suppresseur de tumeur. Cela peut indiquer la manière dont les cellules sénescentes sont régulées pendant l'homéostasie et peut fournir des cibles pour la régénération. En effet, l'inhibition de BRD4 perturbe la capacité des cellules immunitaires à cibler et éliminer les cellules sénescentes pré-cancéreuses in vitro et in vivo [186], suggérant l'efficacité de cette approche.

5.4. Ciblage épigénétique

Pour compléter le génie génétique des macrophages, le ciblage d'enzymes épigénétiques agissant sur la chromatine dans les cellules sénescentes peut également être une approche efficace pour activer les réseaux de régulation génique associés à une « morphologie plus jeune » et peut contribuer à réguler la SASP. Cette approche est prometteuse, car grâce à l'identification de « régulateurs principaux », elle permet la régulation d'un grand nombre de gènes et de réseaux de gènes étroitement liés, au lieu de la manipulation de petits sous-ensembles. En effet, les cellules sénescentes sont connues pour remodeler le paysage épigénétique afin d'induire l'expression de gènes impliqués dans la défense cellulaire et la réponse inflammatoire, dont beaucoup sont caractérisés dans le cadre du SASP [17]. De plus, des altérations de la régulation épigénétique ont été associées à l'immunosénescence, car Menin favorise l'acétylation des histones au niveau du Bach2 locus, supprimant ainsi la sénescence des lymphocytes T, et par la suite, l'immunosénescence [187]. En effet, cette approche concerne également les macrophages et peut réussir à modifier la polarisation des macrophages.

5.5. Modification du comportement des macrophages

La phagocytose des macrophages est régulée par l'activation et l'inhibition des signaux des récepteurs. L'activation des récepteurs des macrophages envoie un signal phagocytaire qui induit le processus de « manger ». Il est important de noter que lors du ciblage des cellules/macrophages sénescents à des fins de régénération/réparation, il est important de noter qu'un résultat optimal sera probablement obtenu grâce à la manipulation prudente, opportune et équilibrée de ce processus. En effet, la littérature a mis en évidence un rôle important des cellules sénescentes dans l'initiation des premiers stades de la réparation et des macrophages dans l'élimination de ces cellules lors de la première « vague » transitoire de réparation. Ce n'est que récemment que la SASP soluble a été identifiée comme ayant deux stades fonctionnels distincts, le premier stade étant un stade hautement anti-inflammatoire enrichi en TGFβ. Ainsi, l'inhibition de ce processus comme démontré par des études antérieures [188] est susceptible d'avoir des impacts négatifs sur la réparation. Cependant, l'activation des macrophages à des points ultérieurs où les cellules sénescentes s'accumulent est susceptible d'être bénéfique. En effet, l'identification des moments auxquels l'intervention est nécessaire/la plus efficace dans différents systèmes organiques sera l'un des aspects les plus difficiles du développement de thérapies efficaces.

6. Conclusion, questions ouvertes et perspectives

Depuis l'idée initiale que la sénescence n'était qu'un résultat naturel du vieillissement, notre compréhension du rôle de la sénescence dans le vieillissement et les maladies humaines a considérablement évolué. Nous sommes maintenant conscients que le programme de sénescence a des rôles plus complexes, notamment dans la régénération et la réparation des tissus, au-delà de nos connaissances actuelles. De plus, le rôle crucial des macrophages dans la réparation et la régénération a également commencé à être démontré au cours de la dernière décennie, en raison de leur rôle bien rapporté lors des blessures. Cependant, à ce jour, de nombreuses questions subsistent concernant leur rôle spécifique dans la régulation des cellules sénescentes suite à une lésion dans différents systèmes organiques, ce qui est compliqué par la nature très hétérogène du programme de sénescence, qui influence directement la fonction des macrophages. Ainsi, pour pouvoir cibler la sénescence à des fins thérapeutiques, un certain nombre de questions ouvertes doivent être abordées, telles que les suivantes. (i) Comment les cellules sénescentes interagissent-elles avec les macrophages, et comment cela change-t-il dans les différentes phases ou « vagues » de la réponse régénérative ? (ii) Comment les changements dans le microenvironnement déclenchent-ils des changements épigénétiques/génomiques/phénotypiques dans les macrophages ? (iii) À quel moment les cellules sénescentes doivent-elles s'accumuler avant que les macrophages ne puissent les éliminer, ou quand les cellules sénescentes commencent-elles à échapper à l'élimination par le système immunitaire ? Surtout, répondre à ces questions permettra de mieux comprendre comment les cellules sénescentes et les macrophages agissent de concert dans le contexte de la lésion et de la réparation, et guidera le développement de traitements ciblant les cellules sénescentes à des fins thérapeutiques.


Les structures SIRP expliquent la spécificité des récepteurs appariés

Le système immunitaire complexe des vertébrés doit être étroitement contrôlé afin de répondre à un défi pathogène sans induire d'effets secondaires inutiles. Alors que des marqueurs solubles tels que les cytokines permettent aux cellules immunitaires de se localiser sur le site de l'infection, des interactions protéine:protéine spécifiques formées entre les cellules affinent la réponse immunologique.

Les protéines de régulation du signal (SIRP) sont une famille de protéines de surface cellulaire exprimées principalement sur les cellules myéloïdes comprenant trois membres : SIRP, SIRPß et SIRP [1] . Alors que les régions extracellulaires des trois sont très similaires, les régions intracellulaires de ces protéines ne se ressemblent pas et elles transmettent des signaux très différents aux cellules. SIRP&alpha reconnaît CD47, une protéine exprimée à la surface de la plupart des cellules qui agit comme un &lsquomarqueur moléculaire de soi&rsquo, et la formation de cette interaction CD47/SIRP inhibe engloutissement des cellules par les macrophages. SIRPß, d'autre part, ne reconnaît pas CD47 et l'interaction de SIRPß avec son ligand extracellulaire (inconnu) stimule l'engloutissement des macrophages. Alors que SIRP reconnaît CD47 avec une affinité plus faible que SIRP, il est exprimé à la surface des cellules T plutôt que des macrophages et on pense qu'il n'a pas de fonction de signalisation directe. Les SIRP caractérisent ainsi la classe de familles de protéines membranaires appelées « récepteurs appariés », qui comprennent plusieurs protéines avec des régions extracellulaires similaires mais des régions transmembranaires/cytoplasmiques radicalement différentes avec des potentiels de signalisation distincts (activant, inhibiteur ou neutre).

Les régions extracellulaires des SIRP comprennent trois domaines d'immunoglobuline (Ig) dans un réseau linéaire. Nous avions précédemment déterminé la structure du premier domaine Ig (amino-terminal) de SIRP [2] . En utilisant la mutagenèse dirigée, nous avons montré que l'interaction avec CD47 était médiée par les boucles N-terminales (apicales) de la SIRP, ressemblant plus à la façon dont les anticorps reconnaissent les antigènes plutôt qu'aux contacts cellule:cellule médiés par le domaine Ig général.

Pour déterminer le mécanisme précis par lequel SIRP reconnaît son ligand, nous avons résolu la structure du domaine SIRP N-terminal en complexe avec le seul domaine Ig extracellulaire de CD47 sous deux formes cristallines par remplacement moléculaire en utilisant des données recueillies à BM14 et ID23-2. La figure 74 montre l'interface CD47/SIRP, qui est différente de celles observées pour d'autres interactions de surface cellulaire médiées par le domaine Ig d'affinité modérée, car elle est très alambiquée, bien ajustée et étendue, avec une implication mutuelle des boucles des extrémités amino-terminales à la fois SIRP et CD47.

74 : La structure de la SIRP humaine en complexe avec CD47. Une représentation schématique des cinq hélices transmembranaires CD47 est montrée.

Contrairement à SIRP, SIRPß et SIRP se lient faiblement ou pas du tout au CD47, malgré le partage d'une identité de séquence de plus de 90 % avec SIRP. Nous avons résolu les structures des domaines N-terminaux de SIRP et de deux isoformes de SIRPß par remplacement moléculaire en utilisant les données recueillies à BM14. Ces structures démontrent l'exquise sélectivité de l'interface d'interaction SIRP. Dans l'ensemble, les structures des SIRP , ß et sont très similaires ( Figure 75 ). Cependant, pour les deux isoformes de SIRPß, des différences d'acides aminés spécifiques par rapport à la SIRP ont pu être identifiées, ce qui a pour résultat l'incapacité de SIRPß à se lier à CD47. De plus, en introduisant une seule mutation d'acide aminé dans la séquence d'une isoforme de SIRP&beta, nous avons pu conférer la capacité de lier CD47 avec une affinité proche de celle de SIRP.

75 : une) Superposition de SIRPß et SIRP sur le complexe CD47/SIRP montre que les SIRP ont des structures très similaires. Cependant, seule la SIRP se lie au CD47 avec une affinité élevée. b) Les sites de polymorphisme d'acides aminés SIRP (sphères rouges) se séparent de l'interface d'interaction CD47/SIRP.

Le domaine de liaison au ligand N-terminal de SIRP a une variabilité de séquence beaucoup plus élevée que la plupart des autres récepteurs de surface cellulaire. La cartographie de cette variabilité de séquence sur la structure du complexe CD47/SIRP montre que la plupart des polymorphismes SIRP&betaa résident loin de l'interface d'interaction (Figure 75), ce qui implique que la variabilité de séquence ne module pas la force de l'interaction CD47. Nous proposons que la force motrice de cette variabilité de séquence pourrait être d'éviter la reconnaissance de la SIRP par les agents pathogènes, ce qui exploiterait la capacité de la SIRP à réguler à la baisse l'activité des macrophages. Une extension de l'idée que SIRP pourrait être une cible pour les agents pathogènes est que SIRPß peut avoir évolué pour imiter les régions extracellulaires de SIRP, sa structure similaire mais opposée (activant) l'activité de signalisation servant à contrecarrer les tentatives des agents pathogènes d'exploiter le potentiel inhibiteur de SIRP .

La structure de SIRP en complexe avec CD47, ainsi que les structures de SIRPß et SIRP isolément, nous ont montré en détail moléculaire comment ce récepteur apparié se lie à son ligand et comment de subtiles variations d'acides aminés dans les régions de liaison au ligand expliquent le ligand exquis sélectivité de la famille SIRP. La séparation des polymorphismes SIRP loin de l'interface d'interaction CD47 suggère que le défi pathogène peut conduire au polymorphisme SIRP. La pression de l'agent pathogène sur le récepteur inhibiteur fournit un raison d&rsquoêtre pour l'existence de récepteurs appariés, avec leurs structures extracellulaires similaires mais des potentiels de signalisation opposés.


Nous remercions le Dr Kun Dong d'avoir aidé BK avec la ligature de gCD47 dans le vecteur CAS9GFP.

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Mots clés : radiorésistance, épigénétique, CD47, thrombospondine-1, réponse aux dommages à l'ADN, schlafen-11, cancer de la prostate

Citation : Kaur S, Schwartz AL, Jordan DG, Soto-Pantoja DR, Kuo B, Elkahloun AG, Mathews Griner L, Thomas CJ, Ferrer M, Thomas A, Tang SW, Rajapakse VN, Pommier Y et Roberts DD (2019) Identification de Schlafen-11 comme cible de la signalisation CD47 qui régule la sensibilité aux rayonnements ionisants et aux inhibiteurs de la topoisomérase. Devant. Oncol. 9:994. doi: 10.3389/fonc.2019.00994

Reçu : 15 août 2019 Accepté : 16 septembre 2019
Publié: 01 octobre 2019.

Ira Ida Skvortsova, Université de médecine d'Innsbruck, Autriche

Jih-Hwa Guh, Université nationale de Taïwan, Taïwan
Katerina Smesny Trtkova, Université Palacký, Tchéquie

Copyright © 2019 Kaur, Schwartz, Jordan, Soto-Pantoja, Kuo, Elkahloun, Mathews Griner, Thomas, Ferrer, Thomas, Tang, Rajapakse, Pommier et Roberts. Il s'agit d'un article en libre accès distribué sous les termes de la Creative Commons Attribution License (CC BY). L'utilisation, la distribution ou la reproduction dans d'autres forums est autorisée, à condition que le ou les auteurs originaux et le ou les titulaires des droits d'auteur soient crédités et que la publication originale dans cette revue soit citée, conformément aux pratiques académiques acceptées. Aucune utilisation, distribution ou reproduction non conforme à ces conditions n'est autorisée.

† Ces auteurs ont contribué à parts égales à ce travail

‡ Adresse actuelle : Anthony L. Schwartz, Morphiex Biotherapeutics, Boston, MA, États-Unis
David R. Soto-Pantoja, Wake Forest School of Medicine, Winston-Salem, Caroline du Nord, États-Unis


Résumé 5218 : Développement d'une thérapie anti-CD47 pour les tumeurs cérébrales pédiatriques.

Introduction : La caractérisation moléculaire approfondie des tumeurs cérébrales effectuée ces dernières années s'est avérée précieuse pour la classification des tumeurs, la stratification du risque et la prédiction des résultats pour les modalités de traitement actuelles. Cependant, la norme de soins actuelle n'a pas amélioré le pronostic et comporte un risque accru de troubles cognitifs pour les enfants atteints de tumeurs cérébrales. Une caractéristique de la progression et de la récidive tumorale est sa capacité à échapper au système immunitaire. Notre hypothèse est qu'en modulant le système immunitaire inné, nous pouvons améliorer la capacité des macrophages à « manger et tuer » les cellules cancéreuses du cerveau. Des données récentes suggèrent que l'interaction entre l'antigène de surface cellulaire CD47 et son partenaire de liaison SIRPα est un mécanisme par lequel les tumeurs solides et non solides peuvent échapper au système immunitaire inné. Pour voir si la thérapie anti-CD47 est une thérapie potentielle dans les tumeurs cérébrales pédiatriques malignes, nous avons d'abord examiné l'expression de CD47 dans des échantillons de patients fraîchement isolés et post-mortem provenant de 4 types de tumeurs différents, le gliome pontique intrinsèque diffus, le médulloblastome, l'épendymome et les ATRT. Nous avons testé l'hypothèse selon laquelle le blocage de l'interaction CD47-SIRPα induisait la phagocytose dans un test de phagocytose in vitro. Nous avons ensuite établi des modèles de xénogreffes orthotopiques chez des souris immunodéprimées et les avons traitées avec un anticorps humanisé anti-CD47, qui est actuellement en cours de développement pour des essais cliniques dans les tumeurs malignes hématopoïétiques et non liées au SNC.

Résultat : l'expression de CD47 était régulée positivement dans tous les types de tumeurs et était présente dans plus de 90 % des cellules dans les tumeurs de haut grade. Une expression accrue de CD47 a été observée dans la population de cellules souches cancéreuses putatives CD15+ et CD133+. Le blocage de l'interaction CD47-SIRPα augmente la phagocytose tumorale par les macrophages in vitro. Le traitement systémique avec un anticorps anti-CD47 a considérablement réduit la charge tumorale dans un cadre de xénogreffe orthotopique.

Conclusion : La thérapie anti-CD47 est une modalité de traitement viable et efficace pour les tumeurs cérébrales pédiatriques de haut grade.

Format de citation : Sharareh Gholamin, Siddhartha S. Mitra, Chase Elliott Richard, Achal Achrol, Doosik Kong, Jun Jae Shin, Michelle Monje-Deisseroth, Yoon-Jae Cho, Irving Weissman, Samuel H. Cheshier. Développement d'une thérapie anti-CD47 pour les tumeurs cérébrales pédiatriques. [abstrait]. Dans : Actes de la 104e réunion annuelle de l'American Association for Cancer Research 2013 du 6 au 10 avril à Washington, DC. Philadelphie (PA): AACR Cancer Res 201373(8 Suppl):Abstract nr 5218. doi:10.1158/1538-7445.AM2013-5218


Voir la vidéo: CD47 blockade in action! (Août 2022).