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Quelles sont les conditions optimales de stockage des stocks de glycérol congelés de bactéries ?

Quelles sont les conditions optimales de stockage des stocks de glycérol congelés de bactéries ?



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La méthode courante de stockage à long terme des bactéries consiste à collecter une culture liquide saturée, telle que le LB, et à la mélanger avec du glycérol stérile de manière à obtenir une concentration finale de 10 à 30 % en glycérol. Le mélange résultant est ensuite congelé, généralement à -80 ou -20C. On dit que les bactéries stockées de cette manière sont viables pendant des années. Je suis curieux de savoir ce qui affecte le succès d'une telle stratégie de stockage ?

  • De toute évidence, la température doit être en dessous de zéro, mais comment la viabilité est-elle exactement affectée ? Le froid est-il toujours meilleur (en supposant que le tube puisse le supporter) ? Y a-t-il des rendements décroissants rapidement après -80C ? Y a-t-il une température optimale ? Je m'attends à quelque chose comme une parcelle de viabilité après 1 an de stockage en fonction de la température, idéalement avec plusieurs espèces.
  • Quelle est la concentration optimale de glycérol ?
  • De combien la viabilité diminue-t-elle par cycle de gel-dégel ?
  • La vitesse de congélation après l'ajout de glycérol est-elle importante ?
  • Bien qu'il soit déconseillé de laisser décongeler un échantillon congelé, la durée de décongélation est-elle importante ? Est-ce que chaque seconde compte, ou y a-t-il peu de différence tant qu'il ne s'agit pas de plusieurs multiples de la durée de la phase de latence ?

Cependant, j'ai trouvé très difficile de trouver des informations spécifiques sur les conditions optimales pour un tel stockage. Par exemple, Addgene prétend que la concentration optimale de glycérol est inconnue. De plus, de nombreux articles plus anciens sur ce sujet sont payants (même de mon institution). Mais l'expérience pour le déterminer serait si insignifiante que je ne peux pas croire que personne ne l'ait fait. Je m'intéresse principalement aux données d'expériences réelles, et je m'intéresse au glycérol seul en tant que cryoconservateur.


Protocole de congélation de bactéries à l'aide de glycérol

Le protocole suivant fournit une alternative au kit de congélation bactérienne d'OPS Diagnostics. Ce kit est un produit prêt à l'emploi qui comprend 162 flacons (avec billes et glycérol), deux racks cryogéniques et des étiquettes jet d'encre/laser résistantes aux solvants.

Les bactéries peuvent être congelées à l'aide d'une solution à 15 % de glycérol. Le processus est simple et nécessite des tubes de microcentrifugation à bouchon à vis et du glycérol stérile. Le glycérol est dilué à 30 % pour qu'il soit facile à pipeter. Des quantités égales de 30% de glycérol et de bouillon de culture sont mélangées, distribuées dans des tubes puis congelées. Un kit est disponible (Bacterial Freezing Kit) via OPS Diagnostics qui simplifie la préparation de tubes stériles pour ce processus.

Préparer une solution à 30% de glycérol (v/v) en mélangeant 30 ml de glycérol avec 70 ml d'eau. Transférer la solution dans une bouteille en verre à bouchon à vis et stériliser par autoclavage à 121°C pendant 15 min. Desserrez le bouchon pendant l'autoclavage.

Aliquoter 500 µl de glycérol stérile à 30 % dans des tubes de microcentrifugeuse stériles de 2 ml contenant des billes de verre de 4 mm*.

Ajouter 500 µl de culture bactérienne dans le tube et mélanger avec le glycérol à l'aide d'un agitateur vortex.

Étiquetez le tube avec le nom de l'organisme, la souche, la date, etc.

Placer le tube dans le congélateur et noter son emplacement.

Pour activer les bactéries, il suffit de retirer quelques billes du tube. Les le tube n'a pas besoin d'être décongelé. Ouvrir le tube et desserrer quelques billes à l'aide d'un embout de pipette stérile. Versez les perles en vrac sur une plaque de gélose et roulez-les. Les colonies qui se développent doivent être à nouveau striées. Replacez immédiatement le tube dans le congélateur. Si la culture dégèle, ne la recongelez pas car les cellules sont généralement très sensibles à la congélation et à la décongélation. Jeter la culture décongelée de manière appropriée.

* Nous préférons les tubes avec bouchon à vis et bouchons avec joints toriques. Une option consiste à remplir le tube au 1/3 avec des billes de verre de 4 mm (numéro de produit BAWG 4000-200-18) avant de stériliser. Lors de la récupération des bactéries, retirez ou découpez une perle sur une plaque de gélose et roulez-la pour disperser les bactéries. Cela évite de décongeler tout le stock.


Stockage à long terme des souches bactériennes

Les méthodes de conservation à long terme autorisent des intervalles de plusieurs mois voire plusieurs années entre les repiquages. Les isolats peuvent être conservés indéfiniment s'ils sont maintenus congelés à -70°C ou en dessous de ces températures peuvent être obtenues dans un « ultra-congélateur » (-70°C) ou un congélateur à azote liquide (-196°C).

La lyophilisation ou le stockage à -70°C ou moins est la meilleure méthode pour la conservation à long terme de la culture bactérienne et le stockage général des isolats à -20°C n'est pas recommandé.

Lyophilisation

La plupart des organismes peuvent être conservés avec succès après lyophilisation (lyophilisation). La lyophilisation consiste à éliminer l'eau des suspensions bactériennes congelées par sublimation sous pression réduite. Les cultures lyophilisées sont mieux maintenues à 4°C ou moins. La sublimation se produit lorsqu'un liquide congelé passe directement à l'état gazeux sans entrer dans une phase liquide.

  1. précongeler le produit pour former une structure congelée,
  2. séchage primaire pour éliminer la plupart de l'eau,
  3. et un séchage secondaire pour éliminer l'eau liée.

Il est recommandé d'utiliser des vitesses de refroidissement lentes car cela entraînera la formation de structures verticales de cristaux de glace, permettant ainsi une sublimation plus efficace de l'eau du produit congelé. Les produits lyophilisés sont hygroscopiques et doivent être protégés de l'humidité pendant le stockage.


Matériaux

  • Récipients de culture contenant des cellules cultivées en phase logarithmique de croissance
  • Milieu de croissance complet
  • Agent cryoprotecteur tel que le DMSO (utiliser un flacon réservé à la culture cellulaire ouvert uniquement sous une hotte à flux laminaire) ou un milieu de congélation tel que Synth-a-Freeze Cryopreservation Medium ou Recovery Cell Culture Freezing Medium
  • Tubes coniques stériles jetables de 15 ml ou 50 ml
  • Réactifs et équipement pour déterminer le nombre de cellules viables et totales (par exemple, compteur de cellules automatisé Invitrogen Countess II FL, ou hémocytomètre, compteur de cellules et bleu Trypan)
  • Flacons de stockage cryogénique stériles (c.-à-d. flacons cryogéniques)
  • Appareil de congélation à vitesse contrôlée ou chambre à isopropanol
  • Conteneur de stockage d'azote liquide

Pour congeler les cellules adhérentes, en plus des matériaux ci-dessus, vous aurez besoin de :


INTRODUCTION

À l'aide des postulats de Koch&# x02019s pour l'identification des microbes pathogènes, Ogston a identifié l'agent étiologique des abcès suppuratifs (Ogston, 1883). Le nom Staphylococcus aureus a été choisi pour distinguer cette espèce avec son pigment de colonie jaune caractéristique d'un autre staphylocoque commensal qui forme des colonies blanches (Staphylocoque albus, désormais désigné Staphylococcus epidermidis) (Rosenbach, 1884 Götz et al., 2006). S. aureus présente plusieurs propriétés microbiologiques frappantes, par exemple, le microbe lie les immunoglobulines et s'agglutine avec ou coagule le sang et le plasma (Loeb, 1903 Much, 1908 Forsgren et Sjöquist, 1966 Cheng et al., 2011). Ces traits ont été utiles pour le diagnostic précoce et rapide de S. aureus infections (pour un historique du test de la coagulase, suivez le lien http://www.microbelibrary.org/index.php/library/laboratory-test/3220-coagulase-test-protocol).

Tous Staphylocoques poussent en grappes, une caractéristique qui peut être visualisée par microscopie et qui explique le nom grec σταΦυλoκoκκoς ou baie ressemblant à du raisin. Le regroupement est causé par la séparation incomplète des cellules filles après division dans trois plans perpendiculaires alternés (Tzagoloff et Novick, 1977 Giesbrecht et al., 1998). S. aureus les cellules apparaissent parfaitement sphériques avec un diamètre de

1 μm (Giesbrecht et al., 1998).S. aureus produit également de la catalase lorsqu'il est appliqué sur du matériel de colonie, le test de la catalase est un test rapide et utile pour distinguer les staphylocoques d'autres bactéries Gram-positives telles que les streptocoques.

S. aureus est un anaérobie facultatif qui se développe par respiration aérobie ou par fermentation, qui produit principalement de l'acide lactique. La bactérie métabolise le glucose via la voie des pentoses phosphates (Reizer et al., 1998). Il n'y a aucune preuve de l'existence de la voie Entner-Doudoroff, cependant, les enzymes de l'ensemble du cycle de l'acide tricarboxylique et une F0F1-ATPase typique sont codées par le génome de S. aureus (Kuroda et al., 2001). En cas d'épuisement du glucose, S. aureus les cellules qui se développent dans des conditions aérobies oxydent le D-galactose, l'acétate, le succinate et le malate. Un excellent résumé de ces voies métaboliques a été récemment publié (Götz et al., 2006).

ATTENTION : S. aureus est un agent pathogène hautement virulent et adaptable ayant la capacité d'infecter, d'envahir, de persister et de se répliquer dans n'importe quel tissu humain, y compris la peau, les os, les organes viscéraux ou le système vasculaire (Lowy, 1998). L'organisme a été placé dans le groupe de risque de niveau 2. Toutes les manipulations avec S. aureus les souches doivent être effectuées conformément aux mesures de biosécurité de niveau 2, y compris des travaux expérimentaux dans des enceintes de biosécurité certifiées. Les lignes directrices pour la pratique BSL2 peuvent être obtenues à partir de la dernière édition de Biosécurité dans les laboratoires microbiologiques et biomédicaux (BMBL, 5e édition) via le lien Web CDC suivant : http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/.


Protocole

Noter: C. difficile est un agent pathogène humain et animal qui peut provoquer des maladies gastro-intestinales. Des expériences impliquant C. difficile doit être effectuée avec des précautions de biosécurité appropriées (BSL-2).

1. Utilisation et entretien de la chambre anaérobie

C. difficile est un anaérobie strict et est extrêmement sensible même à de faibles concentrations d'oxygène dans l'atmosphère. Par conséquent, un environnement anaérobie contrôlé est nécessaire pour sa manipulation réussie. L'utilisation d'une chambre anaérobie (Figure 1A) fournit l'environnement le plus stable et les conditions idéales pour une culture efficace de C. difficile et autres bactéries anaérobies 14 . Ici, une atmosphère contenant un mélange gazeux (5% CO2, 10 % H2, 85 % N2) peut être maintenu de manière stable.

Pour introduire des objets dans la chambre sans contamination significative par l'oxygène, un sas doit être utilisé (Figure 1B). Cet appareil fonctionne comme un échangeur de gaz et fonctionne automatiquement, semi-manuellement ou manuellement. Le sas comporte deux portes : l'une donnant accès à l'extérieur du sas et l'autre donnant accès à l'intérieur de la chambre anaérobie. Selon le modèle, le sas peut avoir une porte supplémentaire, qui peut donner accès à une chambre anaérobie attenante, économisant ainsi le coût d'un sas séparé. À moins de déplacer activement des objets dans ou hors de la chambre, les deux portes doivent rester fermées en tout temps pour éviter la contamination par l'oxygène. Le sas possède un interrupteur marche/arrêt en façade et un panneau contenant quatre boutons. Les conduites de gaz et le tuyau de la pompe à vide sont connectés à l'arrière du sas, près du panneau où se trouvent les interrupteurs pour le fonctionnement manuel complet de l'unité. Il est recommandé que deux cycles de purge, utilisant de l'azote gazeux (N2), sont utilisés avant le remplissage de l'échangeur avec un mélange gazeux (5 % de CO2, 10 % H2, 85 % N2) pour réduire la quantité d'oxygène introduite dans la chambre. Il est également important de ne jamais laisser l'une ou l'autre des portes ouvertes plus longtemps que le temps nécessaire pour déplacer les objets dans et hors de l'échangeur et de planifier soigneusement les expériences pour réduire la fréquence de déplacement des objets dans et hors de la chambre. Les différentes procédures opératoires pour les chambres anaérobies en vinyle sont décrites ci-dessous. Avant de suivre ces protocoles, assurez-vous qu'ils sont compatibles avec les instructions du fabricant fournies avec la chambre.

Mode Automatique Il s'agit d'un mode programmable et personnalisable et entièrement réalisé par le sas. Pour programmer le sas, reportez-vous aux instructions du fabricant. Un programme recommandé pour une entrée typique dans la chambre implique deux cycles de purge utilisant de l'azote gazeux suivis du remplissage du sas avec un mélange gazeux qui correspond étroitement à l'atmosphère maintenue dans la chambre. Au cours de chaque cycle de vide, les procédures d'usine standard suggèrent de tirer un vide à 20 inHg et de purger à 1 inHg.

Assurez-vous que la porte intérieure du sas est complètement fermée.

Ouvrez la porte extérieure du sas.

Placez les articles dans le sas et fermez la porte extérieure du sas. En cas d'introduction de liquides, dévissez les bouchons à mi-course pour assurer un échange gazeux efficace. Les emballages et les conteneurs scellés doivent être ouverts avant le début du cycle, sans quoi cela pourrait se déformer et endommager la vaisselle et les conteneurs en plastique. Pour maintenir la stérilité, ouvrez suffisamment les emballages pour ne permettre qu'un échange gazeux efficace.

Attendez que le sas ait parcouru le programme et que l'affichage indique « Anaérobie ».

Déplacez les objets dans la chambre.

Mode semi-manuel Ce mode peut être utilisé lors du déplacement d'objets dans ou hors de la chambre et est nécessaire lorsque le recyclage du gaz dans la chambre est requis.

Assurez-vous que la porte intérieure du sas est complètement fermée.

Ouvrez la porte extérieure du sas.

Placez les articles dans le sas et fermez la porte extérieure du sas. En cas d'introduction de liquides, dévissez les bouchons à mi-course pour assurer un échange gazeux efficace. Les emballages scellés, tels que les boucles d'inoculation et les plaques à 96 puits, doivent être ouverts avant le début du cycle.

Appuyez sur Start. Le sas affichera la fonction de chaque bouton et ne répondra qu'une fois cette opération terminée :

Flèche haut : active la pompe à vide.

Flèche vers le bas : lance le flux de gaz d'azote (purge).

Démarrage : lance le flux de mélange de gaz.

Menu : retour à l'affichage par défaut.

Appuyez sur "Up", en supprimant le gaz du sas, jusqu'à ce que l'écran affiche 20 inHg.

Appuyez sur "Down", en remplissant le sas avec de l'azote, jusqu'à ce que l'affichage indique moins de 1 inHg. Ne pas dépasser, car cela créerait une pression positive dans le sas, ce qui pourrait affecter son intégrité.

Répétez les étapes 6 et 7 pour effectuer un cycle de purge supplémentaire.

Appuyez sur "Up" jusqu'à ce que l'affichage indique 20 inHg.

Appuyez sur « Démarrer », en remplissant l'échangeur avec un mélange de gaz, jusqu'à ce que l'affichage indique moins de 1 inHg.

Déplacez les objets dans la chambre.

Mode manuel Ce mode peut être utilisé chaque fois que les modes automatique ou semi-manuel ne fonctionnent pas ou que le sas n'est pas alimenté. Ce mode ne fonctionne pas lorsque le sas est activé, il est donc difficile de déterminer la pression à l'intérieur du sas. Étant donné que les temps d'aspiration et de purge de gaz dépendent respectivement des débits de vide et de gaz, l'utilisation d'un manomètre à l'intérieur de l'échangeur est nécessaire pour surveiller la pression et réduire le risque de blessures et d'endommagement du sas.

Assurez-vous que la porte intérieure du sas est complètement fermée.

Ouvrez la porte extérieure du sas.

Placez les articles, y compris le manomètre, dans le sas et fermez la porte extérieure du sas. En cas d'introduction de liquides, dévissez les bouchons à mi-course pour assurer un échange gazeux efficace. Les emballages scellés, tels que les boucles d'inoculation et les plaques à 96 puits, doivent être ouverts avant le début du cycle.

Localisez les trois interrupteurs à l'arrière du sas étiquetés « Interrupteurs de commande manuelle ». Ceux-ci sont individuellement étiquetés comme :

Basculez l'interrupteur à bascule Vers le vide jusqu'à ce que le manomètre indique environ 20 inHg.

Basculez l'interrupteur à bascule d'azote jusqu'à ce que le manomètre indique environ 1 inHg.

Basculez l'interrupteur à bascule Vers le vide jusqu'à ce que le manomètre indique environ 20 inHg.

Basculez l'interrupteur à bascule d'azote jusqu'à ce que le manomètre indique environ 1 inHg.

Basculez l'interrupteur à bascule Vers le vide jusqu'à ce que le manomètre indique environ 20 inHg.

Basculez l'interrupteur à bascule du mélange de gaz jusqu'à ce que le manomètre indique environ 1 inHg.

Déplacez les objets dans la chambre.

2. Culture, dénombrement et stockage C. difficile à partir d'échantillons de selles

Cette procédure est conçue pour récupérer C. difficile à partir d'échantillons fécaux contenant des spores et conservent ensuite des colonies isolées sous forme de cellules végétatives ou de spores en stockage à long terme sous forme de stocks de glycérol. Alternativement, cette procédure peut être utilisée pour énumérer le nombre de C. difficile présent dans les échantillons de selles (par exemple. à partir d'études animales). Pour enrichir sélectivement et différentiellement pour C. difficile, la gélose taurocholate-céfoxitine-cyclosérine-fructose (TCCFA) est utilisée pour inhiber la croissance de la flore fécale normale 15-16. La cyclosérine est bactériostatique pour les bactéries Gram-négatives, tandis que la céfoxitine inhibe plus largement la croissance des bactéries Gram-négatives et -positives, à l'exception de C. difficile et la plupart entrent dans les souches de cocci. Un indicateur de pH, rouge neutre, peut être inclus dans le milieu, car la fermentation du fructose entraînera une diminution du pH et un changement de couleur subséquent du rouge/orange au jaune. Pour récupérer efficacement les spores de C. difficile en tant que bactéries végétatives, le sel biliaire taurocholate de sodium est utilisé pour induire la germination 17-18. Parce que C. difficile formes de spores, l'alcool ou le traitement thermique des échantillons peuvent être utilisés pour réduire ou éliminer les cellules végétatives, limitant la croissance de la flore contaminante, ce qui peut augmenter l'efficacité de C. difficile récupération 19 . Comme mentionné ci-dessus, il est essentiel de pré-réduire toutes les plaques pendant au moins 1-2 heures dans la chambre anaérobie avant utilisation pour assurer l'élimination de l'oxygène résiduel. Le séchage à l'air des plaques avant utilisation dans la chambre peut réduire la condensation. Le milieu liquide peut nécessiter jusqu'à 24 heures pour réduire en fonction du volume et du rapport surface-air du récipient utilisé.

Avant de commencer, les éléments suivants doivent être placés dans la chambre anaérobie :

Anses d'inoculation stériles

Plaques TCCFA (voir Matériaux)

Plaques et bouillon BHIS (Brain Heart Infusion medium avec extrait de levure) (voir Matériaux)

* Alternativement, les colonies isolées peuvent être étalées sur des plaques de gélose BHIS, puis grattées et remises en suspension dans un milieu liquide BHIS avec 15 % de glycérol pour un stockage à long terme à -80 ° C. **Il est important de noter que la coloration de Gram n'est pas une stratégie efficace pour identifier C. difficile directement à partir d'échantillons de selles 23 C. difficile doit d'abord être isolé des autres flores présentes dans les selles.

Remettre en suspension l'échantillon de selles dans 1x PBS (cela peut être effectué dans des conditions aérobies) et s'assurer que l'échantillon de selles est entièrement remis en suspension dans 1x PBS par vortex. Si énumérer C. difficile à partir des selles, peser l'échantillon de selles avant l'ajout de 1x PBS.

Faire des dilutions en série de l'échantillon de selles remis en suspension dans 1x PBS pour l'isolement ou le dénombrement approprié des unités formant colonie (CFU) par gramme de selles.

En utilisant une technique aseptique, appliquez 100 μl de chaque dilution en série sur des plaques de TCCFA.

À l'aide d'une série de boucles d'inoculation stériles, rayez la culture appliquée pour les colonies isolées ou étalez uniformément la culture appliquée sur la surface de la plaque TCCFA pour le dénombrement des colonies.

Incuber la plaque en anaérobie pendant 48 heures à 37 &# x000b0C. Il est possible de détecter et d'identifier C. difficile colonies dans les 24 heures sur la base de l'aspect plat, irrégulier et en verre dépoli des colonies 15, bien qu'une identification et un dénombrement plus précis soient obtenus après 48 heures.

À l'aide d'anses d'inoculation stériles, repiquez toutes les colonies qui semblent être C. difficile sur des plaques de gélose BHIS pré-réduites, additionnées de 0,03 % de L-cystéine 20 . Choisissez une colonie individuelle et étalez sur la plaque en quadrants, en utilisant une nouvelle boucle d'inoculation stérile pour chaque quadrant, pour obtenir des colonies isolées. Sinon, comptez le C. difficile colonies de chaque dilution (cela peut être effectué dans des conditions aérobies) et calculez le nombre d'unités formant colonie par gramme d'échantillon de selles.

Confirmer C. difficile identification par coloration de Gram. Après coloration de Gram, C. difficile apparaîtront sous forme de bâtonnets violets et certaines cellules peuvent contenir des endospores terminales. L'identification par réaction en chaîne de la polymérase (PCR) des gènes qui codent pour la toxine B peut fournir une confirmation supplémentaire des souches toxigènes de C. difficile 21 tandis que le typage de séquences multilocus (MLST) est efficace pour l'identification et le typage précis de souches inconnues et non toxigènes de C. difficile 22 .

Pour maintenir un stock de C. difficile à -80 °C, prélever une colonie isolée isolée de la plaque de gélose BHIS à l'aide d'une anse d'inoculation stérile et remettre la colonie en suspension dans 10 ml de milieu liquide BHIS pré-réduit additionné de 0,03 % de L-cystéine.*

Incuber une nuit en anaérobiose à 37 ଌ, ou jusqu'à ce que la culture devienne trouble.

Ajouter 333 μl de 50% de glycérol et 666 μl de la C. difficile culture dans un tube cryogénique de 1,8 ml pour créer un stock de glycérol à 15 % de la souche isolée.

Fermez hermétiquement le tube cryogénique, mélangez bien et retirez immédiatement le stock de la chambre anaérobie et placez-le dans un congélateur à -80 ° C pour un stockage à long terme.

3. Cultiver C. difficile à partir de stocks de glycérol congelés

Cette procédure permet de récupérer C. difficile à partir de stocks de glycérol stockés à -80 ଌ. Étant donné que des cycles de gel-dégel répétés peuvent tuer les cellules végétatives, il est important de conserver les stocks de glycérol congelés à tout moment. Nous ne recommandons pas l'utilisation de glace carbonique pour transférer les souches à l'intérieur et à l'extérieur de la chambre car l'évaporation de la glace carbonique peut modifier l'environnement à l'intérieur de la chambre. Au lieu de cela, nous vous recommandons d'utiliser des grilles de refroidissement congelées pour conserver les stocks de glycérol congelés pendant le transport. À diverses fins sélectives et différentielles, trois milieux sont couramment utilisés pour la culture C. difficile. Le TCCFA, comme indiqué ci-dessus, est sélectif pour C. difficile et contient du taurocholate de sodium, un germe. L'infusion cerveau-cœur additionnée d'extrait de levure (BHIS) est un milieu couramment utilisé, enrichi et non sélectif qui permet la croissance d'une grande variété d'organismes (Figure 2A) 24 . Fréquemment, la L-cystéine est ajoutée au BHIS en tant qu'agent réducteur 20 . Enfin, l'ajout de sang au milieu (Figure 2B) permet une sporulation plus efficace que sur le TCCFA et permet la détection de la fluorescence verdâtre ou chartreuse unique présentée par C. difficile sous une lumière ultraviolette (UV) à ondes longues 15 (Figure 2C). Lors de la culture C. difficile des stocks de spores, il est essentiel de se rappeler que du taurocholate de sodium doit être ajouté au milieu pour assurer la germination.

Avant de commencer, les éléments suivants doivent être placés dans la chambre anaérobie :

Bouillon de glycérol congelé (dans une grille de refroidissement)

Anses d'inoculation stériles

Plaques TCCFA ou BHIS (voir Matériaux)

Placer le bouillon de glycérol congelé de C. difficile dans une grille de refroidissement qui a été stockée à -80 ଌ avant utilisation pour éviter la décongélation.

Apportez le stock de glycérol congelé sur de la glace sèche dans la chambre anaérobie.

À l'aide d'une technique aseptique et d'une anse d'inoculation stérile, placez une petite quantité de bouillon sur la plaque et étalez sur un quadrant de la plaque.

Faites pivoter la plaque de 90 & x 000b0 et, à l'aide d'une nouvelle anse d'inoculation stérile, continuez à rayer le deuxième quadrant.

Répétez l'opération pour les troisième et quatrième quadrants pour assurer l'isolement des colonies individuelles.

Retirez immédiatement le stock de glycérol congelé de la chambre anaérobie et revenez à -80 ଌ.

Incuber la plaque en anaérobie pendant la nuit à 37 &# x000b0C. Les colonies isolées individuelles doivent être observées après une nuit de croissance.

4. Purifier les spores de C. difficile

Comme la sporulation est nécessaire à la survie dans des environnements riches en oxygène et à une transmission efficace de la maladie 8, la préparation de stocks de spores est souvent nécessaire pour les applications en aval, non limitées à la microscopie et aux études sur les animaux. Il est important de noter que le dénombrement des spores nécessite une répétition pour assurer la reproductibilité des dénombrements. Le pipetage de haut en bas plusieurs fois entre les dilutions réduit également les pertes puisque les spores adhèrent bien au plastique.

Sporulation de C. difficile n'est pas aussi rapide ou homogène que d'autres espèces sporogènes. Pour optimiser la production et la récupération des spores, un milieu de sporulation (SMC) 17,25 ou un milieu 70:30 26 est recommandé. Les autres milieux couramment utilisés sont le BHIS, qui nécessite 4 à 5 jours de croissance avant qu'une sporulation efficace ne soit observée 27 , et le Clospore, un milieu liquide qui produit des titres élevés de spores (10 7 à 10 8 spores par millilitre) après 72 heures de croissance. D'autres protocoles utilisent de l'eau glacée plutôt que 1x PBS 20, cependant, l'utilisation d'une solution isotonique peut réduire le collage des spores les unes aux autres et aux surfaces en plastique. Alternativement, certains chercheurs purifient davantage leurs spores en utilisant un gradient de saccharose pour éliminer complètement les cellules végétatives et les débris 29 .

Avant de commencer, les éléments suivants doivent être placés dans la chambre anaérobie :

Anses d'inoculation stériles

Plaques BHIS, SMC et/ou 70:30 (voir Matériaux)

1x PBS, stérilisé par filtre (voir Matériaux)

Culture des souches à partir de stock de glycérol congelé sur des plaques BHIS pré-réduites et incuber en anaérobiose pendant la nuit à 37 &# x000b0C.

Réétaler sur plusieurs plaques SMC pré-réduites ou 70:30 et incuber en anaérobie à 37 ଌ pendant 24-48 heures. La formation de spores peut être suivie par microscopie à contraste de phase. Les spores apparaîtront en phase claire tandis que les cellules végétatives et mères apparaîtront en phase sombre. *Comme alternative, les spores peuvent être purifiées à partir d'un milieu liquide 70:30 après 24-48 heures, ce qui donne 10 5 -10 6 spores par millilitre, selon la souche utilisée.

À l'aide d'une anse d'inoculation stérile, gratter les plaques et remettre en suspension les cellules dans 10 ml de PBS 1x stérile.

Jeter les plaques et retirer la suspension de spores de la chambre anaérobie. Pellet les cellules à 3000 x g pendant 15 minutes. Laver les cellules deux fois dans 1x PBS, remettre en suspension complètement le culot cellulaire à chaque fois.

Incuber pendant la nuit à 4 ଌ pour aider à la lyse des cellules végétatives et mères.

Incuber à 70 ଌ pendant 20 min pour tuer toutes les cellules végétatives résiduelles.

Pour déterminer les unités formant colonie (UFC) par millilitre, diluer en série chaque préparation de spores dans 1x PBS et plaquer sur BHIS + 0,1% de taurocholate de sodium. Incuber les plaques pendant au moins 24 heures avant de dénombrer les colonies.

Les spores peuvent être stockées dans 1x PBS à température ambiante ou à 4 ° C pour un stockage à long terme. Si stocké à 4 ଌ, il peut être utile de réchauffer la préparation de spores à 55 ଌ pendant 15 min pour restaurer une germination efficace.


Quelles sont les conditions optimales de stockage des stocks de glycérol congelés de bactéries ? - La biologie

Une discussion approfondie sur le stockage des anticorps et la durée de conservation des anticorps.

La « durée de conservation » du stockage des anticorps peut aller de plusieurs semaines à plusieurs années en fonction à la fois des propriétés intrinsèques de l'anticorps et des conditions de stockage. Il a été démontré qu'un certain nombre d'anticorps de diagnostic conservent leurs fonctionnalités après 12-26 ans de stockage à 4°C [2]. Cependant, les conditions optimales de stockage sont propres à chaque anticorps. Par exemple, Laskowski TJ et al ont découvert que leurs mélanges d'anticorps de panel de cytométrie en flux à 17 couleurs restaient stables jusqu'à 15 jours à 4°C tandis que les cocktails d'anticorps CyTOF avaient une durée de stockage maximale de 3 jours à 4°C [3]. Néanmoins, certaines directives générales peuvent être appliquées pour augmenter la durée de conservation de vos anticorps en stockage. Les anticorps doivent être conservés dans des plages de température et de pH appropriées, et fréquemment, en présence de concentrés (

1 M) des substances comme le glycérol ou le saccharose, afin de conserver l'activité et d'empêcher l'agrégation. De nombreux réactifs d'anticorps disponibles dans le commerce contiennent un ou plusieurs additifs décrits ci-dessous qui sont destinés à augmenter la stabilité des anticorps pendant un stockage à long terme. Le tableau 1 résume les conditions courantes de stockage des anticorps et d'autres caractéristiques.

aqueux, 4°C25-50% glycérol ou éthylène glycol, -20°Ccongelé à -20 - -80°C ou dans l'azote liquidelyophilisé *1
durée de conservation typique1 mois1 anannéesannées
concentration d'anticorps1-5 mg/ml1-5 mg/ml1-5 mg/ml1-5 mg/ml
protéines porteuses pour dilutionBSABSABSAnon
exigence stérile ou antibactérienneOuid'habitudenonnon
antioxydantsgénéralement 2-ME, TNT *2 généralement 2-ME, TNT *2 nonnon
conjugaison de fluorescenceprotéger de la lumièreprotéger de la lumièreprotéger de la lumièreprotéger de la lumière
PH7.2-7.67.2-7.6rienrien
chélateur de métalEDTAEDTAnonnon
utilisations multiples d'une seule aliquoteOuiOuiaucun cycle de gel-dégel ne dégrade les anticorps [4] non applicable

De nombreux fournisseurs de réactifs fournissent également des anticorps uniquement PBS (sans additifs stabilisants ou protéines porteuses telles que BSA, ou azoture de sodium ou glycérol), qui peuvent être utilisés dans des réactions de conjugaison avec des colorants et des enzymes, ou dans des tests fonctionnels/cellulaires, ou dans des tests vivants. -expériences d'imagerie cellulaire. Ces anticorps uniquement PBS ont tendance à être fournis à des concentrations plus élevées.

Lors du stockage d'anticorps en dessous de zéro, il est important de NE PAS utiliser de réfrigérateurs sans givre. De nombreux réfrigérateurs ménagers ont une fonction antigel qui effectue des cycles de gel-dégel pour empêcher la formation de givre. Ces cycles de gel-dégel répétés peuvent réduire considérablement la durée de conservation des anticorps.

De nombreux anticorps destinés aux expériences de marquage sont conjugués à des colorants fluorescents. L'exposition à la lumière peut blanchir ces colorants et réduire considérablement leur fluorescence. De tels anticorps conjugués doivent être protégés de l'exposition à la lumière, par exemple en les stockant dans des flacons sombres ou dans des flacons recouverts d'une feuille d'aluminium.

Des réactions chimiques telles que l'oxydation et la dégradation protéolytique des protéines se produisent à des températures modérées, cependant, la fréquence de ces réactions est beaucoup plus élevée à des températures plus élevées. Les anticorps sont généralement stockés à ≤ 4℃ dans de la verrerie ou des tubes en polypropylène propres et stériles. Le stockage à température ambiante conduit souvent à la dégradation et/ou à l'inactivité des anticorps, résultant généralement de la croissance microbienne. Pour un stockage à court terme (1 jour à quelques semaines), des solutions mères d'anticorps bien préparées peuvent être stockées à 4°C sans perte significative d'activité. Dans de mauvaises conditions de stockage de 40° pendant 2 semaines à un pH de formulation typique de 6,0, des résidus d'aspartate et d'asparagine dans les « points chauds » de dégradation de la variable Fv région se sont avérés être modifiés dans jusqu'à 39 % des molécules d'anticorps [5].

La formation de cristaux de glace peut détruire la structure des protéines et donc rendre les anticorps inefficaces. Les cryoprotecteurs tels que le glycérol et l'éthylène glycol empêchent la formation de cristaux de glace en inhibant la liaison hydrogène entre les molécules d'eau, et diminuent ainsi les points de congélation des solutions aqueuses. Le point de congélation réel dépend des propriétés et de la concentration des cryoprotecteurs (voir tableau 2).

(Remarque : l'éthylène glycol est toxique et doit être manipulé avec précaution.)

Lorsque la température de stockage est inférieure au point de congélation d'une solution cryoprotecteur-anticorps, la solution se solidifie. Cependant, au lieu de la formation de cristaux de glace, la vitrification se produit généralement, comme dans la cryoconservation des cellules/embryons avec du DMSO. Pendant la vitrification, la solution se solidifie sans formation de cristaux et ainsi l'intégrité structurelle des anticorps est maintenue.

Pour une stabilité accrue, du glycérol ou de l'éthylène glycol peuvent être ajoutés à une concentration finale de 50 % et l'anticorps peut ensuite être stocké à -20 °C. Cette solution d'anticorps doit être stockée dans de petites aliquotes de travail, par exemple 25 ul [6], afin qu'elles soient soumises à moins de cycles de congélation-décongélation qui peuvent dénaturer les anticorps.

Étant donné que le glycérol peut être contaminé par des microbes, il est essentiel d'utiliser des préparations de glycérol stériles lors de son utilisation pour le stockage d'anticorps.

Les préparations d'anticorps doivent toujours être stérilisées par filtration à l'aide d'un filtre de 0,45 micron et doivent être manipulées de manière aseptique pour éviter la contamination microbienne. Agents antimicrobiens tels que l'azoture de sodium (NaN3) à une concentration finale de 0,02 à 0,05 % (p/v) ou du thimérosal à une concentration finale de 0,01 % (p/v) ou du ProClin 300 à 0,02 % peuvent également être utilisés pour inhiber la croissance microbienne.

Le plus couramment utilisé de ces agents antimicrobiens est l'azoture de sodium, qui est toxique pour la plupart des organismes, y compris les humains. La plupart des bactéries à Gram négatif sont bien contrôlées par l'azoture de sodium (voir figure 1) [7] cependant, de nombreuses bactéries à Gram positif (streptocoques, pneumocoques, lactobacilles) sont résistantes à l'azoture de sodium (voir figure 2) [1, 8, 9] . L'azoture de sodium inhibe la cytochrome oxydase dans la chaîne de transport d'électrons mitochondriale et induit l'apoptose [10]. Les anticorps contenus dans une solution d'azoture de sodium ne doivent PAS être utilisés directement dans des cellules vivantes ou dans des in vivo études. De plus, l'azoture de sodium interfère avec la plupart des réactions de conjugaison, en particulier les conjugaisons dépendantes du groupe amine. Si des conjugaisons doivent être effectuées, l'azoture de sodium peut être éliminé relativement facilement par filtration sur gel ou dialyse, par exemple, DiaEasy Dialyzer MWCO 12-14 kD de BioVision [11].

Thimerosal contains mercury, and is very toxic by inhalation, ingestion, and in contact with skin. It may also cause allergic reactions among a certain population of people. Thimerosal was used as a preservative for medicines and vaccines until it began being phased out in 1999 due to concerns about potential toxicity.

The active ingredients of ProClin 300 are 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one and 2-methyl-4-isothiazolin-3-one, inhibitors of Kreb cycle enzymes α-ketoglutarate dehydrogenase, succinate dehydrogenase, and NADH dehydrogenase. According to Sigma, one of its suppliers, it presents no health hazards, toxicology problems, or disposal issues at recommended usage levels (0.03 – 0.05%), and thus is considered a safe alternative to sodium azide and thimerosal.

Antibody proteolysis by proteases can be an important issue for storing ascitic fluid and serum preparations since both preparations contain proteases. Typically cold storage (≤ -20° for long term and 4° for short term) is sufficient to prevent significant proteolytic degradation of the antibody. However, protease inhibitor cocktails, available from several suppliers, may be added to the antibody solution if proteolytic cleavage becomes a problem.

Dilute antibody solutions are more prone to inactivation and physical losses as a result of low-level non-specific binding to the storage vessel surfaces. Thus, it is advisable to keep antibody concentration high (e.g. >1 mg/mL) during storage.

If the concentration of an antibody is low, stabilizer proteins (sometimes referred to as carrier or filler proteins), such as purified bovine serum albumin (BSA) or gelatin, can be added to a final protein concentration of 1-5 mg/ml (0.1-0.5%). These stabilizer proteins competitively inhibit/reduce surface tension and non-specific absorption to storage tube and pipette surfaces. These added proteins can also help reduce proteolysis of antibodies.

Research has found that use of dry ice during protein storage and transport can cause acidification of the storage solution and potentially protein aggregation (with or without precipitation), especially with acidic proteins (those proteins with pI less than 7) [12]. Polyclonal IgG tends to be acidic, with a pI range of 4.7-7.5 [13]. Gas-sealed vials and/or gas-sealed plastic bags (for bagging the vials) should be used to minimize CO2 reaching the antibody solution. Additionally samples should be re-equilibrated in a -80°C freezer for a couple of days. Dri-Shield Moisture Barrier Bags from 3M, Thermo Scientific™ Nunc™ Cryoflex products, and IMPAK bags like 0203PM56OZETN and 05MP081OZE can be useful.

The effect of oxidation on antibody molecules has been extensively studied, especially for therapeutic antibodies (e.g., [14] ). Several residues of the antibodies, especially methionine and tryptophan, have been found to be susceptible to oxidation in the presence of UV light, elevated temperatures or oxygen radicals [15-18], and oxidation of these residues can alter both the stability and the function of the antibodies.While oxidation does not generally present a problem with antibodies used in research, there are antioxidants, such as 2-ME or DTT, that can slow this oxidation. Recent research suggests free methionine may be a particularly useful antioxidant for protein storage [19].

Freeze-drying (lyophilization) is the method of choice for long term storage of monoclonal antibodies because lyophilized antibodies are much more stable than they are in solution. Lyophilization involves drying antibodies at a very low temperature, reducing the damage to the products and retaining the molecular integrity. It extends the shelf life of antibodies, substantially eases the shipping temperature requirement and preserves their chemical and biological properties. Lyophilized antibodies are stable for 3-5 years without losing activity if stored at -20°C or below. Generally, the antibodies should be stored lyophilized until they are needed and reconstitution performed shortly before use. Lyophilized antibodies can be reconstituted by adding deionized or distilled water and inverting the container 5-6 times at room temperature. The reconstituted antibody can be stored for several weeks at 2-8°C or for up to 1-2 years at ≤ -20°C.

Antibody stability in a dry solid state is sensitive to pH [20], which plays a dominant role in determining the physical stability of the IgG1 in the lyophilized state, with pH 5.0 being the most stable. There are more aggregates and more secondary/tertiary structure changes at lower pH [20]. Thus buffer salts are generally required in a protein formulation to control the pH and minimize protein degradation during freeze-drying. Residual moisture content also plays a key role in maintaining the stability of the antibodies. Chang et al. found that optimal stability of the pure IgG1 antibody was at a water content of 2%-3% [21]. The lowest water content is not necessarily the optimal condition, and the residual moisture should be optimized during formulation development.

Proteins undergo denaturation, often forming intermolecular β-sheet structures, upon lyophilization in the absence of stabilizers. Different stabilizers such as sugars (sucrose and trehalose are the most used stabilizers) or polyols (glycerol and sorbitol) are normally added to the formulations to protect monoclonal antibodies against degradation during lyophilization and storage. However, a recent article indicates that trehalose or maltitol may not be lyoprotective, at least for pure polyclonal antibdies [4]. The presence of sucrose in a formulation can help preserve the native structure of the protein in the solid state and inhibit physical instability during long-term storage [21]. Enhanced protein stability is imparted by the amorphous mannitol due to the inability of mannitol to crystallize during freeze-drying, potentially through hydrogen bonding interaction of the polyol to protein sidechains. Sugars in combination with polyols are more effective at preventing aggregation than sugar or polyol alone, as evidenced by the disaccharide/mannitol formulations maintained native structure better than mannitol only formulations. Addition of a small amount of sorbitol to a sucrose-based formulation resulted in greater retention of native structure and improved stability [21].

The level of stabilization afforded by sugars or polyols generally depends on their concentrations. Increasing sugar/polyol concentration to a certain level may eventually reach a limit of stabilization or even destabilize a protein during lyophilization, so a specific molar ratio of stabilizer to protein is required for storage stability of a lyophilized monoclonal antibody. Many stability studies are performed using iso-osmotic concentrations of sugars (e.g., 275 mM sucrose or trehalose). Jeffrey et al. found a sugar-to-protein molar ratio of 360:1 was sufficient to provide storage stability of rhuMAb HER2, and the sugar concentration was 3-4 fold below the iso-osmotic concentration typically used in formulations [22]. The level of stabilizers used for protein protection during lyophilization depends on the formulation composition, concentration and physical properties of the stabilizer, and its compatibility with the protein. Long-term storage for antibodies at room temperature or above may be achieved by lyophilization via proper selection of the molar ratio and sugar mixture.

The mechanism of stabilization by sugars during drying is either that sugars produce a glassy matrix to restrict mobility (glass dynamics mechanism) and/or act as a water substitute (water substitute mechanism). Most studies supported the latter mechanism. The interaction between water and proteins is critical to the conformational stability of the proteins. When water is removed during drying, the stabilizers can form hydrogen bonds with the protein, as water molecules do, thereby preserving the native protein structure during the lyophilization process.

Lyophilization is a good choice to achieve the desired long term storage for antibodies at room temperature. However, problems still exist [4]. Proteins can become unstable during lyophilization processes and/or long term storage. Lyophilization is a method with poor efficiency, high energy consumption and large investment in equipment. There is no simple, universal protocol in formulating antibodies, and trial-and-error is still required on most occasions.

Aromatic amino acid residues in proteins can absorb UV-light, and light was shown to induce conversion of Trp to Gly and Gly hydroperoxide in IgG1 [23]. Chemicals, such as detergents like Tween 80, in antibody solutions, may introduce additional photosensitivity to antibodies [24]. Additionally, some antibodies are conjugated to fluorescent labels that can quickly bleach with light exposure. Thus prolonged exposure of antibody products to light (especially UV light) is not advisable [25].

Proteins, including antibodies, can aggregate and degrade when subjected to mechanical stresses incurred during vortexing, shaking and vial-dropping [26-28]. This is at least partially due to the cavitation and exposure of proteins in the air [28]. For this reason it is best to treat antibody samples relatively gently. For example, lyophilized antibodies can be reconstituted by gentle inversion rather than vortexing.

Very little loss of activity may occur when serum is directly stored for a decade at ≤ -20°C. However, once the polyclonal antibody is purified, some loss of activity occurs slowly over the years. It also seems that glycerol may not be necessary for storage at -20°C for years or even decades if the antibodies do not go through repeated freeze/thaw cycles. Repeated freeze/thaw cycles damage antibodies [4]. However it is important that the stored polyclonal antibodies should be in high concentration.

Monoclonal antibodies can be stored at -20°C in 50% glycerol.

It is also reported that monoclonal antibodies can be stored under saturated ammonia sulfate as pellets at 4°C or -20°C for many years without loss of activity, bacterial outgrowth or oxidation.

Lyophilization (freeze-drying, or drying from the frozen state) provides an alternative method of stabilizing antibodies that are not freeze-labile. In most situations, freeze-dried proteins can be stored at -20°C.

Conjugated antibodies, especially those with fluorescent labels, should be stored in dark containers or covered in aluminum foil.

Alkaline phosphatase and other enzyme conjugates are particularly sensitive to freezing, and should in general be stored at 4°C for short term after conjugation .

Antibody conjugates are best stored at -20°C with glycerol or ethylene glycol at a final concentration of 50% for the long term. Although some enzyme conjugates may be stored at -20°C without cryoprotectants, frozen stocks must be single-use aliquots to prevent repeated freeze-thaw cycles.

HRP-conjugated antibodies can be stored in 20-30% serum from horse, adult bovine, calf, or rabbit, or in one of many commercial stabilizers or in a combination of both (Oded Babai, Savyon Diagnostics, Israel).

As with any reagents conjugated with fluorescent tags (not just antibodies), fluorescence-conjugated antibodies must be protected from light. Fluorescence can photobleach when exposed to light. Exposure to light may render poor performance and vial-to-vial variation. Fluorophore-conjugated antibodies also should be stored at 4°C and should never be frozen. For example, BD Biosciences issued a rare recall of fluorophore-conjugated antibody reagents due to high-intensity lighting in its warehouse in 2017.


Freezing bacteria pellet protocol

Hi, I'm interested in learning how best to store E. coli pellets at -20° or -80°C. Looking online I can only find stuff about "flash freezing the pellet" or "make a glycerol stock" but I can't seem to find any protocols about how to actually do that (i.e. go from harvested cell pellet --> test tube of cells that can be frozen). Specifically, I'm looking to sonicate + extract/purify protein from these cells. Any advice is appreciated, thank you :)

Just sticking the cells in the freezer might be ok, depending on the stability of your protein, but I suspect in the end you'll want to flash-freeze them.

Done when you don't want cells to die. Briefly, you would resuspend the pellet in fresh media with 30-50% glycerol, then simply place in -80 freezer. The glycerol protects the cells by preventing ice crystal formation, which will lyse the cells. An added advantage is that the glycerol gives the frozen sample an "ice cream" like texture, meaning that when you want to take some live cells out of the freezer for further cell culture, you don't have to thaw the tube at all, just poke in a sterile toothpick or pippette tip and grab some "ice cream"


Antibody storage guide

​Please always check datasheets for specific storage recommendations. We are not able to guarantee antibodies that have not been stored correctly. With proper storage and handling, most antibodies should retain activity for months, if not years.

You can also access our most popular protocols straight from your phone with the Abcam app, which features protocols, scientific support and a suite of useful tools that are handy for any bench scientist. Apprendre encore plus.

Storage temperatures

For many of our antibodies, freezing at -20°C or -80°C in small aliquots is the optimal storage condition. Aliquotting minimizes damage due to freezing and thawing, as well as contamination introduced by pipetting from a single vial multiple times. Aliquots should be frozen and thawed once, with any remainder kept at 4°C.

Upon receiving the antibody, centrifuge at 10,000 x g for 20 seconds to pull down solution that is trapped in the threads of the vial, and transfer aliquots into low-protein-binding microcentrifuge tubes. The size of the aliquots will depend on how much you typically use in an experiment. Aliquots should be no smaller than 10 μL the smaller the aliquot, the more the stock concentration is affected by evaporation and adsorption of the antibody onto the surface of the storage vial.

In most cases storage at 4°C upon receipt of the antibody is acceptable for one to two weeks. It is important to follow the recommendations on the datasheet.

Enzyme-conjugated antibodies should not be frozen at all and should instead be kept at 4°C. Freezing and thawing will reduce enzymatic activity in addition to affecting the antibody binding capacity.

Conjugated antibodies – whether conjugated to fluorochromes, enzymes, or biotin – should be stored in dark vials or wrapped in foil. Exposure to light will compromise the activity of conjugates. Fluorescent conjugates in particular are susceptible to photo-bleaching and should be protected from light during all phases of an experiment.

Antibodies of the IgG3 isotype are unique in their tendency to form aggregates upon thawing and should always be stored at 4°C.

Ascites fluid may contain proteases, and should be frozen as soon as possible after receipt.

​Contamination

To prevent microbial contamination, sodium azide can be added to an antibody preparation to a final concentration of 0.02% (w/v). Many of our antibodies already contain this preservative at concentrations ranging from 0.02 to 0.05%. This will be indicated on the datasheets in the storage buffer section.

When not to use sodium azide

If staining or treating live cells with antibodies, or if using antibodies for in vivo studies, be sure to use preparations that do not contain sodium azide. This antimicrobial agent is toxic to most other organisms as well: it blocks the cytochrome electron transport system.

Sodium azide will interfere with any conjugation that involves an amine group, and should be removed before proceeding with the conjugation. After conjugation, antibodies can be stored in sodium azide. The exception is HRP-conjugated antibodies which should not be stored in buffers containing sodium azide, since the same inhibits HRP. An acceptable alternative is 0.01% thimerosal (merthiolate), which does not have a primary amine.

Sodium azide can be removed from antibody solutions by dialysis or gel filtration. The molecular weight of IgG is 150,000 daltons (IgM is

600,000) the molecular weight of sodium azide is 65 daltons. A micro-dialysis unit with a cut off at 14,000 daltons will retain the antibody as the azide diffuses out.

In a beaker on a magnetic stirrer kept at 4°C, use at least a liter of cold PBS per mL of antibody and stir the dialysis unit for 6 hrs. Change the PBS twice, stirring at least 6 h for each change. If possible, all materials should be sterilized and the resulting preparation should be handled aseptically.

​Freeze/thaw damage

Repeated freeze/thaw cycles can denature an antibody, causing it to form aggregates that reduce its binding capacity.

Storing at -20°C should be adequate for most antibodies there is no appreciable advantage to storing at -80°C. The freezer must not be of the frost-free variety. These cycle between freezing and thawing (to reduce frost-build-up), which is exactly what should be avoided. For the same reason, antibody vials should be placed in an area of the freezer that has minimal temperature fluctuations, for instance towards the back rather than on a door shelf.

Some researchers add the cryoprotectant glycerol to a final concentration of 50% to prevent freeze/thaw damage glycerol will lower the freezing point to below -20°C. While this may be acceptable for many antibodies, only a small percentage of the antibodies we offer have been tested for stability in this storage condition and our guarantee only applies to antibodies stored as recommended on the datasheet. Storing solutions containing glycerol at -80°C is not advised since this is below the freezing point of glycerol. Please be aware that glycerol can be contaminated with bacteria. If adding glycerol or any cryoprotectant, care should be taken to obtain a sterile preparation.

Protein concentration and stability

Diluting antibodies to working concentration and storing at 4°C for more than a day should be avoided. Proteins in general are less susceptible to degradation when stored at higher concentrations, ideally 1 mg/mL or higher. This is the rationale for including proteins such as BSA to the antibody solution as stabilizers. The added protein also serves to minimize loss of antibody due to binding to the vessel wall. Do not add stabilizing protein to antibodies that you intend to conjugate, because they will compete with the antibody and reduce the efficiency of the conjugation.


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