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4.8D : Matrice extracellulaire de cellules animales - Biologie

4.8D : Matrice extracellulaire de cellules animales - Biologie



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La matrice extracellulaire des cellules animales maintient les cellules ensemble pour former un tissu et permet aux tissus de communiquer entre eux.

OBJECTIFS D'APPRENTISSAGE

Expliquer le rôle de la matrice extracellulaire dans les cellules animales

Points clés

  • La matrice extracellulaire des cellules animales est constituée de protéines et de glucides.
  • La communication cellulaire au sein des tissus et la formation des tissus sont des fonctions principales de la matrice extracellulaire des cellules animales.
  • La communication tissulaire est déclenchée lorsqu'une molécule dans la matrice se lie à un récepteur ; les résultats finaux sont des changements de conformation qui induisent des signaux chimiques qui modifient finalement les activités au sein de la cellule.

Mots clés

  • collagène: L'un des plus de 28 types de glycoprotéines qui forment des fibres allongées, généralement présentes dans la matrice extracellulaire du tissu conjonctif.
  • protéoglycane: N'importe laquelle des nombreuses glycoprotéines qui ont des chaînes latérales hétéropolysaccharides
  • matrice extracellulaire: Ensemble des tissus conjonctifs et des fibres qui ne font pas partie d'une cellule, mais fournissent plutôt un support.

Matrice extracellulaire de cellules animales

La plupart des cellules animales libèrent des matériaux dans l'espace extracellulaire. Les principaux composants de ces matériaux sont les protéines. Le collagène est la plus abondante des protéines. Ses fibres sont entrelacées avec des molécules de protéines contenant des glucides appelées protéoglycanes. Collectivement, ces matériaux sont appelés la matrice extracellulaire. Non seulement la matrice extracellulaire maintient les cellules ensemble pour former un tissu, mais elle permet également aux cellules du tissu de communiquer entre elles.

Comment se produit cette communication cellulaire ? Les cellules ont des récepteurs de protéines sur les surfaces extracellulaires de leurs membranes plasmiques. Lorsqu'une molécule dans la matrice se lie au récepteur, elle modifie la structure moléculaire du récepteur. Le récepteur, à son tour, modifie la conformation des microfilaments positionnés juste à l'intérieur de la membrane plasmique. Ces changements de conformation induisent des signaux chimiques à l'intérieur de la cellule qui atteignent le noyau et activent ou désactivent la transcription de sections spécifiques d'ADN. Cela affecte la production de protéines associées, modifiant ainsi les activités au sein de la cellule.

Un exemple du rôle de la matrice extracellulaire dans la communication cellulaire peut être vu dans la coagulation du sang. Lorsque les cellules qui tapissent un vaisseau sanguin sont endommagées, elles présentent un récepteur protéique appelé facteur tissulaire. Lorsqu'un facteur tissulaire se lie à un autre facteur de la matrice extracellulaire, il provoque l'adhésion des plaquettes à la paroi du vaisseau sanguin endommagé et stimule la contraction des cellules musculaires lisses adjacentes dans le vaisseau sanguin (constriction du vaisseau sanguin). Par la suite, une série d'étapes est initiée qui incite alors les plaquettes à produire des facteurs de coagulation.


Publications d'auteurs nommés "Anna Dikalova"

J Physiol 2021 juin 26599 (12) : 3013-3036. Publication en ligne du 26 mai 2021.

Département de pédiatrie, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN, 37232, États-Unis.

Points clés: Les canaux anioniques contenant LRRC8A s'associent à la NADPH oxydase 1 (Nox1) et régulent la production de superoxyde et la signalisation du facteur de nécrose tumorale-α (TNFα). Ici, nous montrons que LRRC8C et 8D co-immunoprécipitent également avec Nox1 dans les cellules musculaires lisses vasculaires. La précipitation de LRRC8C a inhibé la production d'O induite par le TNFα, l'endocytose des récepteurs, l'activation et la prolifération du facteur nucléaire-κB (NF-κB), tandis que la précipitation de LRRC8D a amélioré l'activation de NF-κB. Des changements significatifs dans l'expression de l'isoforme LRRC8 dans l'athérosclérose et le psoriasis humains suggèrent une compensation pour l'augmentation de l'inflammation. L'oxydant chloramine-T (ChlorT, 1 mM) a faiblement (∼ 25 %) inhibé les courants LRRC8C mais fortement (∼ 80 %) inhibé les courants LRRC8D. La substitution des domaines de la boucle extracellulaire (EL1, EL2) de 8D en 8C a conféré une inhibition dépendante de la ChlorT significativement plus forte (69%). L'exposition au ChlorT a altéré le bloc de courant subséquent par DCPIB, qui se produit par interaction avec EL1, impliquant davantage les sites d'oxydation externes. Les canaux LRRC8A/C maintiennent le plus efficacement l'activité Nox1 au niveau de la membrane plasmique. Cela peut résulter de leur capacité à rester actifs dans un microenvironnement oxydé.

Résumé: Le facteur de nécrose tumorale-α (TNFα) active la NADPH oxydase 1 (Nox1) dans les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV), produisant le superoxyde (O) requis pour la signalisation ultérieure. Les protéines de la famille LRRC8 A-E comprennent des canaux anioniques à volume régulé (VRAC). La sous-unité requise LRRC8A s'associe physiquement à Nox1, et l'activité VRAC est requise pour l'activité Nox et la réponse inflammatoire au TNFα. Les courants VRAC sont modulés par les oxydants, ce qui suggère que la sensibilité aux oxydants du canal et la proximité de Nox1 peuvent jouer un rôle physiologiquement pertinent. Dans les CMLV, le knockdown de LRRC8C (ARNsi) a récapitulé les effets de siLRRC8A, inhibant la production d'O extracellulaire et endosomique induite par le TNFα, l'endocytose des récepteurs, l'activation et la prolifération du facteur nucléaire-κB (NF-κB). En revanche, siLRRC8D a potentialisé l'activation de NF-κB. Nox1 co-immunoprécipité avec 8C et 8D, et colocalisé avec 8D au niveau de la membrane plasmique et dans les vésicules. Nous avons comparé les courants VRAC médiés par les canaux LRRC8C et LRRC8D homomères et hétéromères exprimés dans les cellules HEK293. L'oxydant chloramine T (ChlorT, 1 mM) inhibe faiblement 8C, mais inhibe puissamment les courants 8D. L'exposition à la ChlorT a également altéré le blocage de courant ultérieur par le bloqueur de VRAC DCPIB, impliquant des sites externes d'oxydation. La substitution des domaines de la boucle extracellulaire 8D (EL1, EL2) en 8C a conféré une inhibition significativement plus forte des courants 8C médiée par ChlorT. Nos résultats suggèrent que l'activité du canal LRRC8A/C peut être efficacement maintenue dans le microenvironnement oxydé qui devrait résulter de l'activation de Nox1 au niveau de la membrane plasmique. Des rapports accrus d'expression 8D:8C peuvent potentiellement déprimer les réponses inflammatoires au TNFα. La régulation négative des canaux LRRC8A/C représente une nouvelle stratégie pour réduire l'inflammation induite par le TNFα.

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Les isolevuglandines mitochondriales contribuent au stress oxydatif vasculaire et le piégeur d'isolevuglandines ciblé sur les mitochondries réduit le dysfonctionnement mitochondrial et l'hypertension.

Auteurs:

Hypertension 2020 12 576 (6) : 1980-1991. Publication en ligne du 5 oct. 2020

Du Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN (A.D., L.X., V.A., I.Z.-I., A.V., M.A., V.Y., R.R.N., O.B., M.G.L., F.T.B., S. Davies, L.J.Hlov., S.G.Dika

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Réponse de Dikalova et Dikalov à la lettre concernant l'article, "Mitochondrial Deacetylase Sirt3 réduit le dysfonctionnement vasculaire et l'hypertension tandis que l'épuisement de Sirt3 dans l'hypertension essentielle est lié à l'inflammation vasculaire et au stress oxydatif".

Auteurs:

Circ Res 2020 03 26126(7) : e33-e34. Publication en ligne du 26 mars 2020.

De la Division de pharmacologie clinique, Département de médecine, Centre médical de l'Université Vanderbilt, Nashville, TN.

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La thérapie combinée à la l-citrulline et à la tétrahydrobioptérine améliore la signalisation du NO et améliore l'hypertension pulmonaire chronique induite par l'hypoxie chez les porcs nouveau-nés.

Auteurs:

Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2020 04 19318(4):L762-L772. Publication en ligne du 19 février 2020.

Département de pédiatrie, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, Tennessee.

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La désacétylase mitochondriale Sirt3 réduit le dysfonctionnement vasculaire et l'hypertension tandis que l'épuisement de Sirt3 dans l'hypertension essentielle est lié à l'inflammation vasculaire et au stress oxydatif.

Auteurs:

Circ Res 2020 02 19126(4):439-452. Publication en ligne du 19 décembre 2019.

Du Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN (A.E.D., A.P., L.X., L.A., T.S., M.G.L., F.T.B., D.G.H., S.I.D.).

Raisonnement: L'hypertension représente un facteur de risque majeur d'accident vasculaire cérébral, d'infarctus du myocarde et d'insuffisance cardiaque et touche 30 % de la population adulte. Le dysfonctionnement mitochondrial contribue à l'hypertension, mais les mécanismes spécifiques ne sont pas clairs. La déacétylase mitochondriale Sirt3 (Sirtuine 3) est essentielle à la régulation des fonctions métaboliques et antioxydantes associées à l'hypertension, et les facteurs de risque de maladie cardiovasculaire diminuent le niveau de Sirt3.

Objectif: Nous avons émis l'hypothèse qu'une expression réduite de Sirt3 contribue au dysfonctionnement vasculaire dans l'hypertension, mais qu'une augmentation de Sirt3 protège la fonction vasculaire et diminue l'hypertension.

Méthodes et résultats: Pour tester le potentiel thérapeutique du ciblage de l'expression de Sirt3, nous avons développé de nouvelles souris transgéniques avec Sirt3OX global (surexpression de Sirt3), qui protège de la dysfonction endothéliale, du stress oxydatif vasculaire et de l'hypertrophie et atténue l'Ang II (angiotensine II) et la désoxycorticostérone induite par l'acétate de sel hypertension. La déplétion globale de Sirt3 chez la souris entraîne un stress oxydatif dû à l'hyperacétylation de la superoxyde dismutase mitochondriale (SOD2), augmente le HIF1α (hypoxia-inducible factor-1), réduit la cadhérine endothéliale, stimule l'hypertrophie vasculaire, augmente la perméabilité vasculaire et l'inflammation vasculaire (p65, caspase 1 , VCAM [vasculaire cellulaire adhésion molécule-1], ICAM [intercellulaire adhésion molécule-1] et MCP1 [monocyte chemoattractant protein 1]), augmente l'infiltration des cellules inflammatoires dans le rein, réduit l'expression de la télomérase et accélère la sénescence vasculaire et dépendante de l'âge l'hypertension à l'inverse, l'augmentation de l'expression de Sirt3 chez les souris Sirt3OX empêche ces effets délétères. La pertinence clinique de la déplétion de Sirt3 a été confirmée dans les artérioles de la graisse médiastinale humaine chez des patients souffrant d'hypertension essentielle, montrant une diminution de 40 % de la Sirt3 vasculaire, associée à une augmentation de 3 fois de l'acétylation de la SOD2 dépendante de Sirt3, NF-κB (facteur nucléaire kappa-lumière -activateur de chaîne des cellules B activées), les niveaux de VCAM, ICAM et MCP1 chez les sujets hypertendus par rapport aux sujets normotendus.

Conclusion: Nous suggérons que la déplétion de Sirt3 dans l'hypertension favorise la dysfonction endothéliale, l'hypertrophie vasculaire, l'inflammation vasculaire et les lésions des organes cibles. Nos données soutiennent un potentiel thérapeutique de ciblage de l'expression de Sirt3 dans le dysfonctionnement vasculaire et l'hypertension.


Introduction

Protozoaires du genre Acanthamoeba ont été isolés d'environnements distincts à travers le monde, tels que le sol, les réservoirs d'eau, les toilettes publiques ou les sources d'eau environnementales, telles que les lacs et les rivières [ 1 , 2 ]. Les dispositifs médicaux, c'est-à-dire les valves cardiaques [ 3 ] et les lentilles cornéennes, sont également des plateformes pour la croissance de Acanthamoeba sp. le dernier principalement par l'utilisation de solutions de nettoyage contaminées [ 4–6 ].

Les Acanthamoeba Le genre est composé de micro-organismes unicellulaires, qui présentent deux phases distinctes de cycle de vie : les trophozoïtes au stade libre et métaboliquement actifs et le stade de la phase résistante appelé kyste. Les trophozoïtes parasites sont mobiles et présentent des projections épineuses à leur surface, appelées acanthapodia. Ces mouvements sont importants pour Acanthamoeba l'acquisition de nutriments, qui se fait essentiellement par phagocytose de bactéries ou de levures. D'autre part, la forme du kyste non mobile a une paroi à double couche, qui offre une résistance aux adversités environnementales telles que les extrêmes de pH, les températures élevées et les antimicrobiens [ 6-9 ].

Acanthamoeba sp. les infections sont associées à un large éventail de présentations cliniques chez l'homme, mais les affections les plus courantes impliquent les infections des yeux et du système nerveux central [ 6 , 10-12 ]. Acanthamoeba la kératite est l'une des manifestations cliniques les plus courantes et les plus graves causées par cet organisme, suivie de l'encéphalite qui peut causer des dommages irréversibles si elle n'est pas traitée correctement [10, 11, 13-15].

Plusieurs molécules ont été décrites comme ayant un rôle sur Acanthamoeba pathogenèse, aidant les protozoaires à envahir le tissu hôte et à échapper à leurs mécanismes de défense [16, 17]. La sécrétion de glycoprotéines, de protéases et d'autres molécules était corrélée au potentiel pathogène de ces organismes [ 18 ]. Parmi ces composants, les protéases ont été documentées comme les principaux facteurs de virulence et pourraient intervenir dans la destruction des tissus de l'hôte et la digestion des particules phagocytées au sein du micro-organisme [19-21]. En plus des effets des protéases telles que les élastases, les métalloprotéases, les protéases à sérine et à cystéine sur l'invasion tissulaire [21-26], ils sont également directement liés à l'adhésion médiée par les protéines liant le mannose, jouant un rôle important dans l'interaction de Acanthamoeba et la cellule hôte.

Ces dernières années, les vésicules extracellulaires (VE) ont été décrites comme des mécanismes de sécrétion permettant à un large éventail de molécules d'atteindre l'environnement extracellulaire dans un grand nombre d'organismes [27-31]. L'origine cellulaire de ces molécules vésiculaires et le mécanisme exact par lequel elles sont produites restent à déterminer, bien que de nombreuses études suggèrent que ce processus implique des composants des voies de sécrétion conventionnelles et non conventionnelles [32-34]. Cependant, les caractéristiques morphologiques et biochimiques indiquent qu'elles sont similaires à celles décrites dans plusieurs cellules de mammifères [35], contenant des lipides, des acides nucléiques, des composants protéiques et polysaccharidiques [31, 36-38]. Dans le cas d'agents pathogènes fongiques humains importants, bon nombre de ces composants sont associés à la virulence [33, 36, 37, 39, 40].

La production de véhicules électriques a également été décrite chez des protozoaires tels que Plasmodium sp [ 41 ]., Leishmania donovani et L. majeur [ 42 , 43 ], Trypanosoma brucei [ 44 , 45 ], T. cruzii [ 46 , 47 ], chez les helminthes comme les nématodes Echinostoma caproni et Fasciola hépatique [ 48 ], Helingmosomoides polygrus [ 49 ], Teladorsagia circumcincta [ 50 ], le trématode Dicrocoelium dendriticum [ 51 ] et l'amibe Dictyostelium discoideum [ 52 ]. Certains rapports ont souligné l'importance de ces exosomes lors de l'interaction hôte-parasite, agissant comme médiateurs de communication entre les différentes cellules d'organismes distincts, portant ainsi une cible thérapeutique potentielle pour les maladies infectieuses [ 40 , 41 ].

Les mécanismes de sécrétion utilisés par les amibes ne sont pas encore clairs, mais il existe un parallèle avec la libération d'exosomes décrite chez les eucaryotes tels que les parasites, les champignons et les mammifères [53-56]. Dans ces modèles, les véhicules électriques ont été décrits comme étant impliqués dans la sécrétion de protéinases dans l'environnement extracellulaire, avec des implications importantes pour la pathogenèse et la virulence [18, 40, 41, 57] des véhicules électriques Acanthamoeba sp. peuvent contenir des facteurs de virulence importants qui, lorsqu'ils sont sécrétés, peuvent également endommager les tissus de l'hôte. Notre objectif dans cette étude était de caractériser les véhicules électriques produits et sécrétés par A. castellanii. Comme cet organisme peut être trouvé, soit au sein de l'hôte, soit dans l'environnement, à plusieurs endroits avec les concentrations de protéines les plus diverses, nous avons caractérisé le profil du sécrétome de A. castellanii, y compris les VE d'isolement et les fractions sans VE, dans des conditions de disponibilité distincte des sources de protéines. Au fur et à mesure que les véhicules électriques étaient absorbés par les cellules hôtes, le potentiel dommageable et l'activité létale des véhicules électriques et du surnageant sans véhicules électriques pour les cellules hôtes ont été évalués. Nos résultats suggèrent la participation du sécrétome de A. castellanii sur la pathogenèse, ce qui pourrait offrir une nouvelle option pour les interventions thérapeutiques de A. castellanii infections.


Publications d'auteurs nommés "Fred S Lamb"

J Physiol 2021 juin 26599 (12) : 3013-3036. Publication en ligne du 26 mai 2021.

Département de pédiatrie, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN, 37232, États-Unis.

Points clés: Les canaux anioniques contenant LRRC8A s'associent à la NADPH oxydase 1 (Nox1) et régulent la production de superoxyde et la signalisation du facteur de nécrose tumorale-α (TNFα). Ici, nous montrons que LRRC8C et 8D co-immunoprécipitent également avec Nox1 dans les cellules musculaires lisses vasculaires. La précipitation de LRRC8C a inhibé la production d'O induite par le TNFα, l'endocytose des récepteurs, l'activation et la prolifération du facteur nucléaire-κB (NF-κB), tandis que la précipitation de LRRC8D a amélioré l'activation de NF-κB. Des changements significatifs dans l'expression de l'isoforme LRRC8 dans l'athérosclérose et le psoriasis humains suggèrent une compensation pour l'augmentation de l'inflammation. L'oxydant chloramine-T (ChlorT, 1 mM) a faiblement (∼ 25 %) inhibé les courants LRRC8C mais fortement (∼ 80 %) inhibé les courants LRRC8D. La substitution des domaines de la boucle extracellulaire (EL1, EL2) de 8D en 8C a conféré une inhibition dépendante de la ChlorT significativement plus forte (69%). L'exposition au ChlorT a altéré le bloc de courant subséquent par DCPIB, qui se produit par interaction avec EL1, impliquant davantage les sites d'oxydation externes. Les canaux LRRC8A/C maintiennent le plus efficacement l'activité Nox1 au niveau de la membrane plasmique. Cela peut résulter de leur capacité à rester actifs dans un microenvironnement oxydé.

Résumé: Le facteur de nécrose tumorale-α (TNFα) active la NADPH oxydase 1 (Nox1) dans les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV), produisant le superoxyde (O) requis pour la signalisation ultérieure. Les protéines de la famille LRRC8 A-E comprennent des canaux anioniques à volume régulé (VRAC). La sous-unité requise LRRC8A s'associe physiquement à Nox1, et l'activité VRAC est requise pour l'activité Nox et la réponse inflammatoire au TNFα. Les courants VRAC sont modulés par les oxydants, ce qui suggère que la sensibilité aux oxydants du canal et la proximité de Nox1 peuvent jouer un rôle physiologiquement pertinent. Dans les CMLV, le knockdown de LRRC8C (ARNsi) a récapitulé les effets de siLRRC8A, inhibant la production d'O extracellulaire et endosomique induite par le TNFα, l'endocytose des récepteurs, l'activation et la prolifération du facteur nucléaire-κB (NF-κB). En revanche, siLRRC8D a potentialisé l'activation de NF-κB. Nox1 co-immunoprécipité avec 8C et 8D, et colocalisé avec 8D au niveau de la membrane plasmique et dans les vésicules. Nous avons comparé les courants VRAC médiés par les canaux LRRC8C et LRRC8D homomères et hétéromères exprimés dans les cellules HEK293. L'oxydant chloramine T (ChlorT, 1 mM) inhibe faiblement 8C, mais inhibe puissamment les courants 8D. L'exposition à la ChlorT a également altéré le blocage du courant ultérieur par le bloqueur de VRAC DCPIB, impliquant des sites externes d'oxydation. La substitution des domaines de la boucle extracellulaire 8D (EL1, EL2) en 8C a conféré une inhibition médiée par ChlorT significativement plus forte des courants 8C. Nos résultats suggèrent que l'activité du canal LRRC8A/C peut être efficacement maintenue dans le microenvironnement oxydé qui devrait résulter de l'activation de Nox1 au niveau de la membrane plasmique. Des rapports accrus d'expression 8D:8C peuvent potentiellement déprimer les réponses inflammatoires au TNFα. La régulation négative des canaux LRRC8A/C représente une nouvelle stratégie pour réduire l'inflammation induite par le TNFα.

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L'inhibition de la kinase 1 (ASK1) régulant le signal de l'apoptose réduit la production de cytokines endothéliales sans améliorer la perméabilité après la provocation du récepteur de type péage 4 (TLR4).

Auteurs:

Transl Res 2021 20 avril. Epub 2021 20 avril.

Département de pédiatrie, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, Tennessee. Adresse électronique :

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La relation inverse entre la vasodilatation dépendante de l'endothélium et la pression artérielle est perdue après un pontage cardiopulmonaire.

Auteurs:

J Cardiovasc Transl Res 2021 9 avril. Epub 2021 9 avril.

Département des soins intensifs pédiatriques, Vanderbilt University Medical Center, 2200 Children's Way, 5121 Doctors' Office Tower, Nashville, TN, 37232-9075, États-Unis.

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TNFα et signalisation réactive de l'oxygène dans les cellules musculaires lisses vasculaires dans l'hypertension et l'athérosclérose.

Auteurs:

Suis J Hypertens 2020 1033(10):902-913

Division des soins intensifs pédiatriques, Département de pédiatrie, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, Tennessee, États-Unis.


Les références

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4.8D : Matrice extracellulaire de cellules animales - Biologie

Au sein des tumeurs, une interaction complexe entre les cellules cancéreuses et le microenvironnement environnant favorise l'initiation et la progression du cancer. Il est important de noter que ces interactions non seulement façonnent le développement de la tumeur primaire, mais sont également nécessaires au niveau des sites secondaires pour développer un microenvironnement propice à la croissance métastatique. Cette appréciation des interactions dynamiques cancer-stroma dans la progression tumorale a conduit à une transition des tests in vitro traditionnels vers des modèles in vivo plus complexes pour embrasser fidèlement la complexité du cancer. Dans ces modèles, l'imagerie intravitale a été utilisée pour disséquer les événements moléculaires régissant la progression du cancer et a révélé des informations sans précédent sur le comportement des cellules dans leur environnement natif, à la fois dans les tumeurs primaires et sur les sites métastatiques distants. En combinaison avec les approches traditionnelles et statiques utilisées dans la recherche sur le cancer, l'imagerie intravitale a considérablement élargi notre compréhension de la complexité de la biologie du cancer, car elle nous permet d'imager directement la dynamique spatio-temporelle de la progression du cancer dans des environnements vivants et au niveau de l'ensemble de l'organe, des cellules , subcellulaires et moléculaires. Ici, nous décrivons les dernières découvertes facilitées par l'imagerie intravitale des tumeurs, qui ne pourraient autrement pas être réalisées in vitro, et discutons de la façon dont les techniques d'imagerie intravitale utilisées dans d'autres contextes pathologiques pourraient être réutilisées pour la recherche sur le cancer.

Imagerie de la vascularisation tumorale pour étudier la croissance et la dissémination du cancer

Les cellules cancéreuses utilisent et cooptent le stroma environnant pour favoriser leur expansion et leur dissémination. Les vaisseaux sanguins associés aux tumeurs remplissent une double fonction pendant le développement du cancer : ils fournissent au tissu tumoral l'oxygène et les nutriments essentiels, mais peuvent également servir de transporteurs pour les cellules cancéreuses circulantes. Alors que divers modèles ont été développés in vitro pour étudier les systèmes microvasculaires 1 , 2 , plusieurs outils d'imagerie intravitale, tels que les protéines fluorescentes ou les nanoparticules, ont été utilisés pour comprendre les interactions entre les cellules cancéreuses et les vaisseaux sanguins dans des environnements vivants, un aspect qui ne peut pas être récapitulé in vitro 3 – 6 . Par exemple, des lectines marquées par fluorescence, telles que l'agglutinine de Lens culinaris, ont été développées pour se lier sélectivement aux cellules endothéliales 3,4. La co-injection intraveineuse d'agglutinine et de cellules cancéreuses marquées par fluorescence a récemment été utilisée avec l'imagerie intravitale de la membrane chorioallantoïque de poulet embryonnaire (CAM). Il s'agit d'un test de substitution pour l'étude de l'extravasation des cellules cancéreuses et de la colonisation métastatique et a récemment permis de mieux comprendre l'évolution dans le temps et les mécanismes moléculaires impliqués dans l'extravasation des cellules cancéreuses 3 , 4 . Ici, les auteurs ont démontré que les cellules cancéreuses intravasculaires se déplacent initialement le long de l'endothélium luminal d'une manière amiboïde et commencent ensuite à étendre des protubérances entre les cellules endothéliales dans le stroma extravasculaire. Les cellules cancéreuses traversent ensuite progressivement les jonctions cellule endothéliale-cellule, déplaçant même dans certains cas les cellules endothéliales 4 . Il est intéressant de noter que les protéines marqueurs des invadopodes telles que la cortactine ou la MT1-MMP se sont avérées être localisées au niveau des saillies des cellules cancéreuses extravasantes, et la suppression de ces marqueurs a altéré l'extravasation cellulaire et la formation de colonies métastatiques au sein de la CAM 4 . Conformément à cela, l'injection dans la veine caudale de cellules déficientes en invadopodes chez la souris a entraîné une diminution du nombre de métastases pulmonaires, montrant que les invadopodes sont une caractéristique clé de la migration transendothéliale des cellules cancéreuses 4 . De même, fournir des cellules cancéreuses intravasculaires dans le test CAM avec de l'acide hyaluronique, qui est un composant de la matrice extracellulaire (MEC) surexprimé dans de nombreux types de tumeurs 7 & 2013 9 , a conduit à une extravasation cellulaire accrue 3 . L'utilisation de cette sonde a donc démontré que l'ECM représente non seulement une barrière physique contre l'administration de chimiothérapie 10 mais peut également être cooptée par des cellules cancéreuses pour une colonisation de site secondaire.

Les dextranes fluorescents et les nanoparticules à points quantiques (QD) sont également couramment utilisés pour visualiser les vaisseaux sanguins. Plus récemment, ils ont été utilisés au cours de la recherche in vivo sur le cancer pour étudier l'intégrité vasculaire dans les tissus tumoraux vivants 11, 12 . Par exemple, l'imagerie intravitale chronologique des QD dans le modèle murin de cancer du sein MMTV-PyMT a permis à Ormandy et ses collègues de démontrer que les cellules cancéreuses du site primaire peuvent utiliser le système vasculaire environnant pendant la progression du cancer invasif et métastatique 13 . Ici, l'induction ELF5 a entraîné une fuite et une accumulation de QD dans l'espace interstitiel, conformément à la formation de tumeurs hémorragiques, et a augmenté le nombre de métastases pulmonaires (Figure 1A, vaisseaux sanguins en rouge, notez le signal dans les zones autour des vaisseaux qui fuient dans PyMT /souris ELF5 13).En outre, nous avons précédemment utilisé des QD pour cartographier la vascularisation des tumeurs xénogreffes sous-cutanées pancréatiques et avons montré in vivo que l'activité Src et l'inactivation médicamenteuse de la Src dans les cellules cancéreuses sont en corrélation avec leur position par rapport aux vaisseaux sanguins intratumoraux 11 . De nouveaux QD organiques avec une biocompatibilité, une stabilité et une section transversale d'absorption à deux photons améliorées et des nanoparticules virales marquées par fluorescence ont récemment été développés pour la cartographie intravitale en temps réel de la vascularisation sanguine in vivo 14, 15. Des globules rouges marqués par fluorescence et des souris avec des cellules endothéliales marquées par fluorescence ont également été conçus pour marquer le système vasculaire sanguin in vivo 16 &# x2013 18, et avec les QD et le dextran, ces approches sont susceptibles d'améliorer notre compréhension de la façon dont le système vasculaire associé à la tumeur soutient la progression du cancer.

Figure 1. Imagerie intravitale des mécanismes ancillaires favorisant la progression du cancer.

UNE . Imagerie par points quantiques (QD) de l'angiogenèse et de la vascularisation tumorale qui fuit. Adapté de 13. B. Suivi des neutrophiles photo-convertis migrant à travers les réseaux lymphatiques. Adapté de 38 . C. Identification des cellules myélomateuses dormantes logées dans la niche osseuse. Adapté de 48 . RÉ . Visualisation directe du transfert local et systémique des vésicules extracellulaires et des exosomes entre différents compartiments cellulaires. Adapté de 60 . E. Analyse de génération de deuxième harmonique (SHG) de la réticulation du collagène pour identifier de nouveaux régulateurs de l'agressivité induite par la matrice extracellulaire (ECM). Adapté de 74 . F . Suivi longitudinal de la pharmacocinétique et du ciblage de la chimiothérapie à travers une fenêtre optique. Adapté de 93 . G . Dissection de la dynamique spatio-temporelle des événements moléculaires entraînant l'invasion et la dissolution du cancer dans les tissus natifs à l'aide de souris rapporteurs. Adapté de 96 et 103 . Abréviations : CAF, GFP des fibroblastes associés au cancer, protéine fluorescente verte.

Le système lymphatique présente une autre voie de dissémination des cellules cancéreuses. Par exemple, Das et al. récemment utilisé l'imagerie intravitale de cellules de mélanome injectées dans le coussinet adipeux mammaire avec un colorant traceur lymphatique pour visualiser la migration des cellules cancéreuses vers les ganglions lymphatiques drainant la tumeur 19 . Les auteurs ont démontré que les sinus lymphatiques des ganglions lymphatiques, mais pas les lymphatiques périphériques, sécrètent CCL8, qui active CCR1 sur le compartiment des cellules cancéreuses pour permettre l'entrée dans le ganglion lymphatique 19 . L'inhibition de CCR1 n'a pas empêché les cellules tumorales primaires d'entrer dans le système lymphatique, mais a bloqué leur sortie dans le ganglion lymphatique et a arrêté les cellules circulantes dans les vaisseaux lymphatiques voisins. Cela indique que la dissémination des cellules cancéreuses lymphatiques se produit non seulement par le transport passif, mais est également soutenue par la signalisation chimiotactique paracrine 19 . Récemment, un rapporteur transgénique des vaisseaux lymphatiques a été généré en croisant des souris LSL-tdTomato avec des souris Prox1-Cre-ERT2 pour induire une expression de rapporteur fluorescent dans les vaisseaux lymphatiques et cartographier le trafic cellulaire au sein des réseaux lymphatiques 20 . Alors que les auteurs ont utilisé ce modèle pour suivre les cellules dendritiques entrant dans les vaisseaux lymphatiques exprimant tdTomato lors d'une inflammation aiguë in vivo, cette technologie pourrait être réutilisée pour une utilisation future dans la recherche sur le cancer afin de surveiller les cellules tumorales circulantes se disséminant dans le système lymphatique.

Imagerie du système immunitaire associé aux tumeurs

Au cours de la progression du cancer, les cellules tumorales interagissent avec le système immunitaire et le manipulent pour faciliter leur croissance et échapper à la mort cellulaire 21 – 24 . Ici, une double imagerie intravitale des vaisseaux sanguins qui fuient et des cellules immunitaires a été utilisée pour identifier de nouveaux mécanismes d'action des médicaments. En particulier, l'activité antitumorale des bisphosphonates, qui sont couramment utilisés dans les maladies du squelette, telles que l'ostéoporose 25, a été explorée dans un modèle murin de tumeur mammaire 4T1 26 . Ici, il a été démontré que les bisphosphonates marqués par fluorescence pénètrent dans le site tumoral primaire via le système vasculaire qui fuit et se lient aux microcalcifications dans le tissu. Les bisphosphonates ont ensuite été incorporés par les macrophages associés aux tumeurs (TAM), et les auteurs suggèrent que cela pourrait altérer la fonction des TAM 26 , dont il a été démontré qu'ils potentialisent la progression tumorale 27 . Ainsi, l'imagerie intravitale a permis aux auteurs de délimiter un mécanisme d'action inconnu sous-tendant les bénéfices partiels du traitement par bisphosphonates chez les patientes atteintes d'un cancer du sein. Dans cette optique, les TAM ont également été identifiés dans le microenvironnement tumoral des métastases (TMEM), un point chaud de perméabilité vasculaire caractérisé par l'interaction physique entre les cellules tumorales, les TAM et les cellules endothéliales 28 . L'imagerie intravitale du système vasculaire à l'aide de QD et de dextrane fluorescent a démontré que les TAM exprimant Tie2 hi induisent une fuite vasculaire transitoire via la signalisation du facteur de croissance endothélial vasculaire A (VEGFA), facilitant ainsi l'intravasation des cellules tumorales. Fait intéressant, l'imagerie intravitale a également montré que la migration transendothéliale se produisait préférentiellement dans les régions contenant un TMEM, et cibler spécifiquement ce site pourrait ralentir la propagation des cellules cancéreuses 28 . L'imagerie intravitale a également été utilisée récemment pour comparer la motilité de deux types de cellules immunitaires effectrices, les cellules tueuses naturelles (NK) et les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) 29 . Ici, les auteurs ont montré que tandis que les cellules NK forment des contacts courts et rapides avec les cellules tumorales indépendamment de la signalisation calcique, les CTL forment des contacts durables avec les cellules tumorales qui nécessitent un afflux de calcium dans les CTL. Fait intéressant, il a été démontré que les deux types de cellules nécessitent un influx de calcium pour une destruction efficace 29 , ainsi l'imagerie intravitale a fourni de nouvelles informations sur les interactions spécifiques au type cellulaire entre les cellules tumorales et le système immunitaire qui sont nécessaires pour une destruction spécifique et efficace des cellules tumorales pour se produisent et qui ne peuvent pas être reproduits fidèlement in vitro .

Dans le même ordre d'idées, en utilisant l'imagerie intravitale, Moalli et al. caractérisé une voie potentielle par laquelle l'antigène dérivé de tumeur est localement traité et présenté pour générer une réponse immunitaire systémique 30 . L'injection de cellules de mélanome B16.F10, transfectées avec tdTomato comme antigène dérivé de tumeur de substitution, dans le coussinet plantaire de souris a conduit à une réponse immunitaire robuste après 30 jours mesurée par des titres élevés d'IgG 30 anti-B16.F10-tdTomato. L'imagerie des ganglions lymphatiques drainant les tumeurs a montré que tdTomato était localisé dans les macrophages des lymphatiques et également dans les cellules dendritiques folliculaires (FDC). En utilisant des modèles murins de macrophages, de FDC ou de déficience en cellules B, les auteurs suggèrent que tdTomato est absorbé par les macrophages et se localise ensuite avec les FDC, qui sont ensuite scannés par les cellules B, générant une réponse immunitaire systémique 30 . De même, l'imagerie intravitale des tumeurs mammaires exprimant mCherry a été utilisée pour caractériser la présentation de l'antigène au site tumoral 31 . Ici, les auteurs ont montré qu'un sous-ensemble de cellules myéloïdes fonctionne comme des cellules dendritiques tumorales en absorbant et en présentant l'antigène dérivé de la tumeur aux CTL. Fait intéressant, il a été montré que les CTL s'engagent avec les cellules présentatrices d'antigène et sont par la suite arrêtés dans cet engagement, inhibant potentiellement les effets cytolytiques et le rejet de la tumeur. Les auteurs suggèrent que l'immunothérapie tumorale peut aider à libérer le blocage des CTL après leur attraction initiale et leur regroupement avec des cellules présentatrices d'antigène au site tumoral 31 . De même, Boissonas et al. a montré par imagerie intravitale que les lymphocytes T infiltrés peuvent être piégés par des cellules dendritiques tumorales après une chimiothérapie, suggérant que les cellules dendritiques tumorales peuvent fonctionner comme un puits qui retient la réponse immunitaire anti-tumorale induite par les lymphocytes T32. Ces résultats améliorent notre compréhension de la réponse immunitaire au développement du cancer à la fois au niveau des sites primaires et métastatiques, ainsi l'imagerie intravitale peut aider à ouvrir la voie au développement de nouvelles thérapies dérivées de la présentation. Par exemple, l'imagerie intravitale dans le modèle murin de cancer du sein MMTV-PyMT a permis l'identification d'un type de cellule macrophage-dendritique (M-DC) 33 . Ici, les auteurs ont utilisé du dextrane fluorescent pour marquer les M-DC et ont révélé que l'épuisement des M-DC diminue la croissance tumorale et les métastases et pourrait donc présenter une future cible prometteuse 33 . De même, l'imagerie intravitale récente de la migration intratumorale des CTL in vivo a révélé que le traitement avec un mAb anti-CD137 prolonge l'interaction entre les CTL et les cellules cancéreuses, améliorant ainsi l'activité antitumorale des CTL34. Ceci est parallèle aux récentes améliorations de l'immunothérapie anti-PD1 pour éduquer le système immunitaire à reconnaître et à tuer les cellules de mélanome 35 et peut représenter une approche prometteuse pour l'amélioration des thérapies immunitaires dans plusieurs types de cancer.

Plusieurs systèmes rapporteurs fluorescents pour marquer et suivre spécifiquement les cellules immunitaires dans les tissus natifs ont été développés récemment. Un tel exemple est le modèle de souris Catchup 36, dans lequel une cassette bicistronique de Cre et tdTomato a été conçue pour être exprimée sous le locus Ly6G spécifique des neutrophiles. À l'aide de cet outil, les auteurs ont suivi la migration des neutrophiles et étudié les fonctions des gènes spécifiques des neutrophiles in vivo. De même, une souris transgénique avec une expression omniprésente de Kikume, une protéine fluorescente verte (GFP) qui peut être irréversiblement photo-convertie en rouge via une excitation de lumière violette, a été utilisée pour caractériser la cellule dendritique 37 et la migration des neutrophiles 38 in vivo (Figure 1B, single -suivi cellulaire des neutrophiles 38). Par exemple, lors d'une infection bactérienne, les neutrophiles ont été recrutés dans l'oreille de la souris et ont été photo-convertis. Une imagerie intravitale supplémentaire a permis aux auteurs de suivre les cellules photo-converties et d'identifier et de cartographier de nouveaux schémas de migration et de ralliement des neutrophiles dans les ganglions lymphatiques 38 . Un autre exemple est la souris rapporteur transgénique MacGreen dans laquelle l'expression de la GFP pilotée par c-fms est ciblée sur les macrophages, les trophoblastes et les granulocytes 39 . En utilisant ce journaliste, Pai et al. ont pu suivre les leucocytes circulants au cours de la pathogenèse du paludisme cérébral et ont identifié les lymphocytes T CD8+ spécifiques du plasmodium comme d'importants régulateurs de cette maladie 40 . Le croisement de ces modèles animaux rapporteurs avec des modèles murins de cancer peut fournir des informations indispensables sur la façon dont les cellules cancéreuses manipulent et interagissent avec le système immunitaire de l'hôte pour favoriser la progression tumorale. Par exemple, l'imagerie intravitale peut nous permettre d'identifier les voies de migration des cellules immunitaires au cours de la progression et du traitement du cancer ou de caractériser les sous-types immunitaires tumoraux 41, 42 de manière dynamique pour mieux informer sur les immunothérapies du cancer, une caractéristique de la progression du cancer qui ne peut pas être modélisé ou évalué avec précision in vitro .

Les interactions cancer-fibroblastes facilitent la progression tumorale

Les fibroblastes sont également fréquemment recrutés sur les sites tumoraux, et l'imagerie intravitale a récemment été utilisée pour montrer que les fibroblastes du stroma peuvent réguler la réponse tumorale globale à la chimiothérapie. Par exemple, l'imagerie intravitale d'un modèle de xénogreffe de mélanome à travers une fenêtre optique a démontré l'activation paradoxale des fibroblastes associés au cancer (CAF) au site primaire lors du traitement avec des inhibiteurs de Braf, conduisant ainsi à un durcissement accru du compartiment de la MEC 43 . Ici, les auteurs montrent que l'ECM raidie activait à son tour les voies de signalisation médiées par l'adhésion, telles que la kinase d'adhésion focale (FAK), pour favoriser la survie des cellules cancéreuses et ainsi diminuer l'efficacité du traitement anti-Braf 43 . Fait intéressant, l'altération de la tension d'adhésion cellulaire par l'inhibition de la FAK a réduit le refuge fourni par l'ECM et a entraîné une réponse significativement améliorée à la chimiothérapie 43 .

De même, Lee et al. ont utilisé l'imagerie par bioluminescence du corps entier in vivo pour étudier les mécanismes de résistance au traitement anti-insulin-like growth factor (anti-IGF) avec le cixutumumab 44 , qui a récemment montré une efficacité limitée dans les essais cliniques 45 , 46 . Ici, les auteurs ont démontré que lors du traitement avec le cixutumumab, les cellules cancéreuses ont subi une reprogrammation protectrice caractérisée par une production accrue d'IGF, qui à son tour a conduit au recrutement et à l'activation des fibroblastes de l'hôte vers le site primaire via la signalisation paracrine IGF-2R-dépendante. Il a ensuite été démontré que les fibroblastes activés sécrètent des facteurs pro-angiogéniques et potentialisent les métastases et la rechute de la maladie 44 . Leurs résultats étaient également corrélés avec des changements dans le microenvironnement tumoral des patients suivant des thérapies à base d'anti-IGF 44 , suggérant que la prévention de l'activation des fibroblastes peut altérer les mécanismes extrinsèques de chimiorésistance et à son tour améliorer l'efficacité du cixutumumab.

L'imagerie intravitale a également été utilisée pour impliquer les fibroblastes du stroma dans la dormance des cellules cancéreuses, une cause importante de rechute de la maladie, qui reste mal comprise 47 . Dans une étude récente, Lawson et al. ont développé une approche pour l'imagerie intravitale longitudinale des cellules de myélome qui s'étaient logées dans un tissu osseux dense 48 . À l'aide d'un système de dilution de colorant, les auteurs ont pu marquer et suivre les cellules dormantes à prolifération lente au fil du temps et ont montré que ces cellules se logent préférentiellement en contact direct avec la surface de l'os endosté et interagissent avec les cellules osseuses de l'hôte pour établir une niche protectrice pour la persistance. des métastases (voir la figure 1C montrant des cellules dormantes [rouge] logées à la surface de l'os [blanc] et des cellules en prolifération [vert] 48). Il est important de noter que cette étude a démontré que la dormance cellulaire est un état réversible, qui peut être désactivé et désactivé par des signaux émanant des ostéoblastes et des ostéoclastes de l'hôte. Les auteurs suggèrent que l'utilisation de médicaments agissant sur les os pour empêcher la réactivation des cellules dormantes ou pour sortir les cellules de la dormance avant de les traiter par chimiothérapie pourrait améliorer les résultats et réduire les rechutes de la maladie. Leurs découvertes présentent de nouvelles opportunités pour le traitement des cancers métastatiques à tropisme osseux tels que le cancer du sein, de la prostate ou du rein 48 .

Il a également été démontré que les cellules tumorales cooptent les fibroblastes pour favoriser la propagation du cancer, et l'imagerie in situ récente de la colonisation des organes secondaires a été utilisée pour révéler comment les fibroblastes de l'hôte sont impliqués dans la préparation de la niche métastatique 49 . Dans un modèle orthotopique de cancer du sein, la double surveillance des cellules cancéreuses du sein métastatiques et des fibroblastes pulmonaires a récemment révélé que des interactions réciproques entre les deux types cellulaires sont nécessaires pour l'établissement réussi de métastases pulmonaires. Ici, les auteurs démontrent qu'une diaphonie intercellulaire biphasique modifie progressivement les deux compartiments. En bref, l'activation d'un programme fibrotique dans la population de fibroblastes a conduit à l'initiation d'une transition mésenchymateuse à épithéliale dans le compartiment des cellules cancéreuses, favorisant l'apparition de métastases 49 . Ensemble, ces études suggèrent que la prévention de l'activation des fibroblastes et de la reprogrammation induite par les cellules tumorales au cours de la progression du cancer peut aider à améliorer la sensibilité à la chimiothérapie et à nuire à la dissémination du cancer. L'imagerie intravitale des sites secondaires sujets aux métastases est nécessaire pour visualiser directement les étapes de la colonisation métastatique. Cependant, l'imagerie à long terme et en profondeur des organes métastatiques reste techniquement difficile. Les fenêtres d'imagerie optique permettent désormais une imagerie longitudinale et profonde des événements se produisant à la fois au niveau des sites primaires et des organes secondaires tels que le foie, la rate, les reins et le pancréas 50, 51 . Par exemple, le suivi des événements précoces favorisant la formation de la niche métastatique du foie a été réalisé à l'aide de fenêtres d'imagerie optique 52 . Fait intéressant, cette étude a démontré que les cellules extravasées uniques sont initialement très mobiles et prolifératives et forment des pré-micrométastases dans le foie avant de fusionner en micrométastases avec une migration réduite. Il est important de noter que l'altération de la migration précoce des cellules tumorales a considérablement réduit la charge métastatique 52 . De même, la formation du microenvironnement métastatique du foie et la réponse à la chimiothérapie ont été étudiées en utilisant la microscopie multiphotonique à balayage longitudinal dans un modèle intrasplénique de cancer colorectal 50 et informées sur la réponse des cellules métastatiques à la chimiothérapie.

Une limitation à l'imagerie intravitale longitudinale est le mouvement des tissus vivants, tels que le cœur ou les poumons, qui peut perturber l'imagerie intravitale haute résolution, et la recherche actuelle se concentre sur les systèmes de compensation de mouvement pour corriger le mouvement des tissus 53 &# x2013 55 . De plus, la probabilité d'imagerie d'un événement invasif ou métastatique peut être considérée comme très faible, cependant, l'imagerie intravitale optogénétique peut être utilisée pour activer ou inhiber spécifiquement les voies de signalisation et déclencher par la suite un tel événement.

La diaphonie intercellulaire est soutenue par des vésicules extracellulaires

Les interactions réciproques entre le cancer et les cellules stromales nécessitent un échange d'informations, par exemple, sous la forme d'interaction cellule-cellule physique ou de sécrétion de ligands protéiques ou de vésicules extracellulaires (VE). La visualisation directe de la transmission du signal entre les cellules cancéreuses et l'environnement hôte a longtemps été un défi technique, cependant, le développement récent de nouveaux outils d'imagerie intravitale a aidé à élucider les mécanismes qui permettent l'échange intercellulaire d'informations au sein des sites primaires et métastatiques. Des études récentes ont montré que les cellules cancéreuses peuvent manipuler les cellules stromales de l'hôte par le transfert local et systémique d'exosomes et d'autres véhicules électriques 56 – 58 . Par exemple, l'imagerie en direct d'un modèle d'embryon de poulet de fibrosarcome a indiqué que les exosomes favorisent l'assemblage d'adhérence des cellules cancéreuses-ECM et sont nécessaires pour le mouvement cellulaire persistant 59 . En outre, d'élégantes études in situ ont démontré que les exosomes sécrétés par les cellules cancéreuses primaires se localisent au niveau des sites métastatiques secondaires, fusionnent avec les cellules hôtes et peuvent « éduquer » les organes secondaires grâce à l'activation de programmes fibrotiques et inflammatoires 56 , 57 . Conformément à cette étude, l'imagerie intravitale directe de la sécrétion et de l'absorption d'exosomes par différentes populations cellulaires 60, 61 a récemment été réalisée. Ici, Zomer et al. a développé un système basé sur Cre-loxP dans lequel les cellules qui absorbent les véhicules électriques Cre(+) présentent un changement de couleur (voir la figure 1D montrant les cellules Cre[+] [bleu], cellules rapporteurs qui incorporent les véhicules électriques Cre[+] [vert], et les cellules rapporteurs qui n'ont pas 60 ). Avec cette approche, les auteurs ont démontré que les véhicules électriques sont transférés localement et systématiquement des cellules cancéreuses agressives aux cellules cancéreuses moins malignes au sein de la même souris pour coordonner un programme métastatique systémique du corps entier in vivo et pour améliorer la capacité métastatique globale de la tumeur 60 , 61 . Des découvertes récentes démontrent également que l'ADN mitochondrial (ADNmt) peut être transféré des cellules stromales hôtes aux cellules cancéreuses. Ici, les auteurs ont génétiquement manipulé des cellules de mélanome et de cancer du sein pour qu'elles manquent d'ADNmt et ont montré in situ qu'elles peuvent acquérir l'ADNmt de l'hôte pour restaurer les fonctions mitochondriales telles que la dynamique bioénergétique et la respiration.En outre, l'incorporation de l'ADNmt de l'hôte par les cellules cancéreuses a entraîné une croissance tumorale accrue et une propagation métastatique, démontrant que les cellules tumorales peuvent absorber le matériel de l'hôte pour stimuler l'agressivité du cancer 62, 63. Fait intéressant, Osswald et al. utilisé le balayage multiphotonique in vivo des astrocytomes sur une année pour étudier un nouveau mécanisme de connexion intercellulaire 64 , dans lequel les cellules tumorales dans les astrocytomes utilisent des protubérances ultra-longues (>500 μm de longueur) pour former un réseau de communication multicellulaire. Les auteurs montrent que ce réseau favorise l'invasion et la prolifération des cellules tumorales et protège les cellules cancéreuses contre les radiothérapies 64 . Les développements futurs de l'imagerie intravitale pour visualiser directement les mécanismes d'interaction cellule-cellule peuvent nous aider à comprendre comment les cellules cancéreuses et les tissus hôtes interagissent et entraînent ensemble l'agressivité du cancer, et à l'avenir peuvent nous aider à découpler ce mécanisme de soutien.

Imagerie des propriétés biomécaniques de la matrice extracellulaire

Au cours de la dernière décennie, des travaux intensifs ont montré que l'abondance et les caractéristiques de la MEC, telles que la rigidité, la topographie et la porosité, contribuent à la prolifération, à l'invasion et à la chimiorésistance des cellules tumorales 65 – 72 . Les technologies d'imagerie multiphotonique, telles que l'imagerie de génération de seconde harmonique (SHG) 73 , ont été utilisées pour étudier la modulation des caractéristiques de la MEC au cours de la progression du cancer et ont récemment identifié de nouveaux régulateurs des propriétés biomécaniques des tissus (voir la figure 1E montrant le dépôt de collagène dans des organotypiques 3D in vitro matrices fibroblastes-collagène lors de l'induction de P-Rex, un facteur d'échange de guanine pour Rac1 74). Par exemple, le cytosquelette d'actine et un certain nombre de ses protéines régulatrices, telles que la famille des Rho GTPases, sont connus pour régir le remodelage de l'ECM 69 , 75 &# x2013 77 , et l'imagerie SHG en direct a fourni de nouvelles informations sur l'étroite régulation des Rho GTPases in vivo . En collaboration avec Samuel et ses collègues, nous avons aidé à identifier la protéine de signalisation intracellulaire 14-3-3 ζ en tant que nouveau régulateur négatif du raidissement de la MEC induite par la Rho-kinase dans la cicatrisation 78 . Ici, la surveillance en direct des fibroblastes du stroma couplée à l'imagerie SHG des fibres de collagène dans un environnement 3D in vitro a été utilisée pour montrer que la perte de 14-3-3 ζ dans les fibroblastes dermiques altère leur capacité à remodeler le collagène et à rigidifier la MEC, et de tels effets ont également été observés dans des échantillons d'animaux ex vivo 78 . Fait intéressant, cette étude a également montré dans le carcinome épidermoïde que le 14-3-3 ζ est régulé à la baisse tandis que le dépôt de collagène est augmenté, suggérant que la signalisation ROCK n'est plus restreinte et contrôlée in vivo dans cette maladie 69, 78, 79. Ces résultats suggèrent de nouvelles options thérapeutiques pour réutiliser les traitements à base de 14-3-3 ζ pour faciliter une cicatrisation uniforme et contrôlée 78 , qui à l'avenir peuvent également être utilisées dans le contexte du cancer pour rétablir l'homéostasie tissulaire normale de tumeurs solides 69 , 80 , 81 .

L'environnement tumoral hypoxique a également été récemment identifié comme un nouveau régulateur de l'ultrastructure et de la rigidité de la MEC au niveau des sites primaires et métastatiques 82, 83. Par exemple, il a été démontré que l'hypoxie inhibe la protéine du domaine de la prolyl hydroxylase 2 (PHD2) dans les CAF in vitro et in vivo, entraînant une réversion de l'activation des CAF et une diminution de leur capacité à remodeler et à rigidifier l'ECM 82 . De plus, il a été démontré que les protéines sécrétées par les tumeurs hypoxiques préparent et activent la MEC des futurs sites métastatiques. Un tel exemple est l'enzyme lysyl oxydase (LOX), qui est régulée positivement dans les cellules du cancer du sein à tropisme osseux 83 . In vivo, l'injection de LOX a entraîné la formation de lésions ostéolytiques et a à son tour fourni aux cellules cancéreuses du sein circulantes une niche focale pré-métastatique pour la colonisation osseuse, tandis que le ciblage de LOX avec un anticorps bloquant a partiellement inversé ce phénotype et diminué la charge tumorale, comme visualisé par imagerie in vivo du corps entier 83 . L'imagerie SHG intravitale a également été utilisée pour surveiller directement les changements de la structure et du contenu de la MEC au cours de la progression du cancer dans des environnements en direct. Par exemple, Walsh et al. réalisé une imagerie SHG intravitale de xénogreffes de cancer du sein pour étudier les effets du traitement par trastuzumab sur la MEC 84 . Fait intéressant, leur étude a démontré que le trastuzumab induit des changements dans la densité et l'alignement du collagène et a ainsi identifié une réponse non cellulaire au traitement médicamenteux 84 . En outre, une imagerie SHG longitudinale de xénogreffes mammaires orthotopiques a été réalisée au niveau de la marge tumorale pour identifier les composants clés du microenvironnement tumoral qui module l'invasion cellulaire 85 . Ici, les auteurs ont utilisé une double imagerie de cellules individuelles et de fibres de collagène et ont montré que les cellules cancéreuses du sein à locomotion lente forment des invadopodes pour remodeler et rigidifier la matrice de collagène pendant qu'elles se déplacent dans les tissus environnants. L'utilisation ultérieure de l'imagerie SHG intravitale fournira des informations importantes sur le rôle de la MEC et sa manipulation au cours de la progression tumorale.

Les technologies et outils intravitaux en développement rapide ont fourni des informations sans précédent sur la complexité du cancer et ont également ouvert des voies prometteuses pour la recherche préclinique sur le cancer. Par exemple, l'imagerie SHG a récemment été traduite pour étudier les propriétés de la MEC dans des échantillons de biopsie de patients cancéreux. Par exemple, dans le contexte du cancer du pancréas, nous avons récemment utilisé l'imagerie SHG pour analyser les propriétés de la MEC dans un microréseau de tissu pancréatique humain (>80 échantillons) et détecté une corrélation positive entre l'abondance de collagène fibrillaire, le stade tumoral, la propagation des ganglions lymphatiques et invasion vasculaire, ce qui suggère qu'un ciblage précis de la réticulation du collagène peut être une approche valable dans cette maladie 86 . Conformément à cette étude, une analyse biophysique du remodelage du collagène a été menée sur des biopsies de cancer du sein humain (échantillons > gt20) et a révélé une augmentation progressive de la réorganisation et de l'orientation du collagène à mesure que des lésions cancéreuses invasives se développent 87 . De même, dans une cohorte de tissus mammaires humains appariés avec des zones de densité mammographique élevée et faible du même patient (échantillons > gt15), nous avons analysé l'organisation de l'ECM par matrice de cooccurrence de niveaux de gris (GLCM), une approche basée sur la texture d'image utilisée quantifier l'organisation des réseaux de fibres de collagène 88 . Dans cette étude, Britt et ses collègues ont démontré qu'un dépôt et une réticulation accrus de fibres de collagène sont en corrélation avec un risque élevé de développer un cancer du sein 88 . Ensemble, ces études ainsi que nos connaissances sur des modèles animaux intravitaux indiquent que lors de l'acquisition de biopsies humaines, la caractérisation de l'abondance de la MEC et de la réticulation à l'aide de l'imagerie SHG à moyen débit peut potentiellement être utilisée comme biomarqueur pour prédire le pronostic du patient et le stade tumoral. De plus, le développement de nouvelles sondes pour imager directement des composants distincts de la MEC tels que l'hyaluronane 3, 89, l'élastine 90 ou la fibronectine 91 est susceptible de faciliter notre compréhension du rôle de la MEC dans le développement du cancer et peut nous aider à améliorer les thérapies ciblant composants spécifiques de l'ECM.

Nouveaux outils pour l'imagerie en direct, intravitale et in situ dans la recherche translationnelle sur le cancer

Les biocapteurs basés sur la fluorescence sont en train de devenir un outil fiable pour disséquer les mécanismes de l'activité des cibles médicamenteuses et de la chimiorésistance. Dans un large panel de lignées cellulaires résistantes aux inhibiteurs de la MEK (MEKi), l'imagerie en direct de la kinase régulée par le signal extracellulaire (Erk) et des biocapteurs fluorescents S6K a été utilisée pour interroger les bases moléculaires de la résistance à la MEKi dans le cancer du mutant Kras et du mutant Braf. lignées cellulaires in vitro. Ici, les auteurs ont montré que lors du traitement avec MEKi, les voies Erk et PI3K peuvent maintenir l'activité de mTORC1 et à leur tour favoriser la croissance cellulaire, conduisant ainsi à une résistance au traitement 92 . De plus, des médicaments marqués par fluorescence ont été utilisés pour déchiffrer les mécanismes de résistance aux médicaments. Par exemple, un analogue fluorescent de l'éribuline a été conçu pour surveiller la pharmacocinétique des médicaments in vivo. Ici, les auteurs ont conçu une partie des cellules tumorales pour exprimer la protéine de fusion multidrug-resistance 1 (MDR1)-mApple, et la double imagerie de l'éribuline et de MDR1-mApple a démontré que la résistance à l'éribuline était directement corrélée à l'architecture vasculaire et à l'efflux de médicament médié par MDR1. . Cette étude a également démontré que l'inhibition de MDR1 renversait le phénotype multirésistant et améliorait l'efficacité de l'éribuline 93 (Figure 1F montrant l'éribuline fluorescente [verte] diffusant dans le tissu tumoral et incorporée uniquement par les cellules cancéreuses n'exprimant pas la protéine de fusion MDR1-mApple à 1 et 2 heures suivant le traitement à l'éribuline 93 ).

En allant plus loin dans ces approches, pour l'évaluation de l'activité des protéines du tissu entier ou du corps entier, des souris transgéniques ont été générées avec une expression ubiquitaire ou inductible par Cre de rapporteurs de l'activité d'Erk, PKA, Rac1, cAMP ou progression du cycle cellulaire 94 – 99 ( Figure 1G , carte de l'activité Rac où le rouge et le jaune marquent une faible activité Rac et le bleu et le vert mettent en évidence une activité Rac élevée 96 ). Le croisement de ces souris biocapteurs avec des modèles animaux de cancer nous permet de disséquer les mécanismes spatio-temporels des événements moléculaires à l'origine du cancer dans les tissus natifs. Par exemple, Kumagai et al. ont récemment croisé leur souris biocapteur Erk avec un modèle murin de formation de tumeurs mammaires et ont décrit un modèle hétérogène stable d'activité d'Erk 100 . Fait intéressant, les auteurs ont montré que les cellules à faible activité Erk réussissaient mieux à former des sphères tumorales in vitro et exprimaient des marqueurs élevés de cellules souches du cancer du sein par rapport aux cellules à forte activité Erk 100 . Ces résultats indiquent que l'hétérogénéité tumorale dans l'activité d'Erk peut être bénéfique pour établir des cellules souches cancéreuses avec une faible activité d'Erk pour l'auto-renouvellement, alors qu'une activité d'Erk élevée favorise une croissance et une expansion rapides 100 . De même, la dynamique de pulsation et de propagation d'Erk émanant de la peau et du follicule pileux a également été récemment démontrée in vivo 101 et a des implications importantes pour les futures recherches sur le mélanome 102 .

Un autre exemple récent d'imagerie de souris par biocapteur dans le cancer est notre souris E-cadhérine-GFP, qui nous a permis d'effectuer des expériences de photoblanchiment in vivo pour surveiller la dynamique des jonctions cellule-cellule (Figure 1G, Expression de l'E-cadhérine-GFP dans les jonctions cellule-cellule de la glande mammaire en lactation 103). Ici, nous avons utilisé la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et la perte de fluorescence dans l'imagerie par photoblanchiment (FLIP) ainsi que l'analyse par kymographe pour quantifier la mobilité de l'E-cadhérine des tissus sains et malades. En utilisant cette approche, nous avons pu corréler la mobilité élevée de la E-cadhérine dans la membrane cellulaire avec une diminution de la force et de l'intégrité de la jonction et une augmentation de l'invasivité cellulaire 103 . Le croisement de cette souris avec un modèle génétiquement modifié de cancer du pancréas nous a permis de récapituler le spectre complet de la progression du cancer du pancréas et de disséquer les stades génétiques de la dissolution précoce du cancer. Cette souris a également été utilisée comme outil pour la découverte de médicaments en testant de nouveaux agents anti-invasifs, tels que le dasatinib, dans le cancer du pancréas, où nous avons démontré que le dasatinib est capable de renforcer l'intégrité de la jonction cellule-cellule en ligne avec une diminution de l'invasivité dans ce contexte 103 . Ceci est conforme à l'évaluation clinique actuelle chez les patients et à son efficacité connue dans le modèle murin de cancer du pancréas KPC 104 .

Les modèles de souris avec une expression omniprésente de rapporteurs moléculaires peuvent désormais être utilisés pour surveiller les événements dans un large éventail d'organes et de maladies. Cependant, en raison de la diffusion de la lumière dans les tissus, la profondeur d'imagerie avec les lasers à deux photons actuels est limitée à plusieurs centaines de μm , limitant l'imagerie intravitale des gros organes et des tumeurs. Les configurations multiphotoniques actuelles comprennent des lasers à trois photons en combinaison avec des oscillateurs paramétriques optiques (OPO) qui augmentent la longueur d'onde d'excitation, car la lumière rouge et proche infrarouge peut pénétrer plus profondément dans les tissus et réduire la diffusion tissulaire 105, 106. Cela nécessite l'utilisation de protéines fluorescentes qui peuvent être excitées avec des longueurs d'onde du proche infrarouge, telles que les variantes iRFP ou iRFP, qui ont été récemment décrites 107, 108. En outre, des modèles informatiques, tels que la correction optique adaptative, ont été utilisés pour surmonter la diffusion de la lumière et pour augmenter la profondeur d'imagerie 109 . Une autre technique d'imagerie, appelée tomographie photoacoustique (PAT), utilise le phénomène selon lequel l'absorption de photons forme des ondes de pression qui peuvent être détectées. Bien que PAT augmente la profondeur d'imagerie, il réduit fortement la résolution de l'image, qui peut être partiellement surmontée par l'utilisation de protéines fluorescentes dans le proche infrarouge 110, 111. De plus, les démarches actuelles visant à réduire l'optique distale et les composants mécaniques des microscopes intravitaux 112 &# x2013 114 devraient déplacer le domaine vers l'endoscopie intravitale de la biologie du cancer 115 .

Enfin, l'optogénétique, qui repose sur les propriétés inhérentes de la lumière pour observer et contrôler avec précision des événements biochimiques et de signalisation complexes 116, apparaît comme un autre outil prometteur pour interroger la dynamique du cancer. L'optogénétique permet aux chercheurs de manipuler l'expression des gènes ou l'activité des voies de signalisation cellulaire et a récemment permis le photocontrôle des protéines avec une résolution subcellulaire. Ces approches ont été utilisées pour modifier la conformation des protéines 117, stimuler la liaison à l'ADN 118, contrôler l'activité enzymatique 119 ou du récepteur tyrosine kinase 120, induire la localisation des protéines 121, manipuler les interactions protéine-protéine 122 et étudier les événements des voies de signalisation 123, 124. Par exemple, l'optogénétique a été utilisée pour démontrer que l'activité Rac1 localisée est suffisante pour produire des événements de protrusion cellulaire régulés avec précision pour contrôler la motilité cellulaire dirigée in vivo 125 &# x2013 128. Plus important encore, l'optogénétique peut nous permettre de moduler les voies de signalisation liées au cancer d'une manière spatio-temporelle définie et nous permettre de suivre le devenir des cellules dérégulées dans leur environnement in situ. En résumé, l'imagerie intravitale a démontré sa capacité à nous permettre d'explorer les mécanismes auxiliaires soutenant la progression du cancer et de fournir de nouvelles voies pour le développement de futures thérapies pour cibler et altérer ces mécanismes de soutien.

CAF, fibroblaste associé au cancer CAM, membrane chorioallantoïque CTL, ECM cytotoxique des lymphocytes T, matrice extracellulaire ERK, kinase régulée par le signal extracellulaire EV, vésicule extracellulaire FAK, kinase d'adhésion focale FDC, cellule dendritique folliculaire FLIP, perte de fluorescence dans le photoblanchiment FRAP, fluorescence récupération après photoblanchiment GLCM : matrice de co-occurrence de niveaux de gris IGF, facteur de croissance analogue à l'insuline LOX, lysyl oxydase M-DC, cellule macrophage-dendritique MDR1, multi-résistance aux médicaments 1 MEKi, inhibiteur de MEK ADNmt, ADN mitochondrial cellule NK, naturel cellule tueuse OPO, oscillateur paramétrique optique PAT, tomographie photoacoustique PHD2, protéine du domaine prolyl hydroxylase 2 QD, point quantique SHG, deuxième génération harmonique TAM, macrophage associé à la tumeur TMEM, microenvironnement tumoral de la métastase VEGFA, facteur de croissance endothélial vasculaire A.


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Réclamations

1. Vésicule extracellulaire (EV) isolée, dans laquelle l'EV isolé contient une protéine supplémentaire choisie dans le groupe constitué de KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1 (HEL-S-15), VIM , EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8 (HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109 et DKFZp686P132.

2. EV isolé selon la revendication 1, dans lequel l'EV contient une ou plusieurs protéines choisies dans le groupe constitué de CD44, CD109, NT5E, MMP2 et HSPA8.

3. EV isolé selon la revendication 1, dans lequel l'EV isolé est conçu pour contenir la ou les protéines.

4. EV isolé selon la revendication 1, dans lequel l'EV isolé est obtenu à partir d'une cellule.

5. EV isolé selon la revendication 4, dans lequel la cellule est choisie parmi une lignée cellulaire immortalisée ou une cellule primaire.

6. EV isolé selon la revendication 4, dans lequel la cellule est une cellule souche mésenchymateuse (MSC).

7. EV isolé selon la revendication 1, dans lequel la cellule est un non-MSC.

8. EV isolé selon la revendication 7, dans lequel le non-MSC comprend une cellule fibroblastique, ou une cellule macrophage.

9. EV isolé selon la revendication 4, dans lequel l'EV isolé contient une quantité accrue du ou des marqueurs protéiques par rapport à la quantité moyenne dans tous les EV obtenus à partir du MSC.

10. EV isolé selon la revendication 9, dans lequel l'EV isolé contient une quantité accrue d'au moins 20 % du ou des marqueurs protéiques.

11. EV isolé selon la revendication 6, dans lequel le MSC est isolé à partir de gelée de Wharton, de sang de cordon ombilical, de placenta, de sang périphérique, de moelle osseuse, de lavage broncho-alvéolaire (BAL) ou de tissu adipeux.

12. EV isolé selon la revendication 1, dans lequel l'EV isolé est un exosome synthétique produit in vitro.

13. EV isolé selon la revendication 12, dans lequel l'exosome synthétique est un liposome synthétique.

14. EV isolé selon la revendication 1, dans lequel l'EV isolé contient en outre de la Synténine-1, de la Flotilline-1, du CD105 et/ou du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I.

15. EV isolé selon la revendication 1, dans lequel l'EV isolé contient en outre un membre de la famille des tétraspanines.

16. EV isolé selon la revendication 15, dans lequel le membre de la famille des tétraspanines contient CD63, CD81 et CD9.

17. Méthode d'isolement d'une vésicule extracellulaire (EV) ayant une puissance accrue comprenant l'ingénierie de l'EV pour qu'elle contienne une ou plusieurs protéines choisies dans le groupe constitué de KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1 (HEL -S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NTSE, HSPA8 (HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109 et DKFZp686P132.

34. Méthode de traitement d'une maladie ou d'un état associé à une angiogenèse réduite, une inflammation aiguë, une inflammation chronique, une apoptose, un dysfonctionnement mitochondrial, une fibrose ou une vasculopathie, comprenant l'administration à un sujet en ayant besoin de vésicules extracellulaires isolées obtenues à partir de cellules stromales mésenchymateuses, dans laquelle la les vésicules extracellulaires comprennent des vésicules extracellulaires (EV) contenant une ou plusieurs protéines sélectionnées dans le groupe constitué de KRT19, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1 (HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8 (HEL-S-72p), RAB10, CD44, MMP2, CD109 et DKFZp686P132.

113. Méthode de traitement ou de prévention d'une maladie ou d'un trouble respiratoire, comprenant l'administration à un sujet en ayant besoin d'une dose efficace d'une vésicule extracellulaire (EV) isolée, dans laquelle l'EV isolé contient une ou plusieurs protéines choisies dans le groupe constitué de KRT19 , TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB2C, TUBB3, TUBB4B, TUBB6, CFL1 (HEL-S-15), VIM, EEF1A1, EEF1A1P5, PTI-1, EEF1A1L14, EEFA2, ENPP1, NT5E, HSPA8 (HEL-S-72p) , RAB10, CD44, MMP2, CD109 et DKFZp686P132.

114. Procédé selon la revendication 113, dans lequel la maladie ou le trouble respiratoire comprend le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), la maladie pulmonaire aiguë, l'asthme, la maladie pulmonaire obstructive chronique, la fibrose kystique, la pneumonie, la fibrose pulmonaire, la lésion pulmonaire aiguë, la bronchite, l'emphysème, bronchiolite oblitérante ou dysplasie bronchopulmonaire (DBP).

115. Méthode selon la revendication 113, dans laquelle la méthode traite ou prévient une maladie ou un trouble respiratoire résultant de COVID-19.

116. Procédé selon la revendication 114, dans lequel la fibrose pulmonaire est une fibrose pulmonaire idiopathique.

117. Méthode selon la revendication 113, dans laquelle la maladie ou le trouble respiratoire est le résultat d'une infection, d'une septicémie, d'une aspiration acide ou d'un traumatisme.

118. Méthode selon la revendication 113, dans laquelle l'infection est une infection bactérienne ou une infection virale.

119. Méthode selon la revendication 113, dans laquelle la maladie ou le trouble respiratoire est le résultat d'une infection par le SRAS-CoV-2.

120. Méthode selon la revendication 113, dans laquelle la méthode comprend l'administration d'EV à un patient à risque de développer une maladie ou un trouble respiratoire.

121. Procédé selon la revendication 113, dans lequel la dose efficace de l'EV isolé est de 20 à 500 pmoles de phospholipides d'EV par kg de sujet traité.

132. Méthode selon la revendication 113, dans laquelle les EV isolés sont administrés par voie parentérale.

133. Méthode selon la revendication 113, dans laquelle la méthode comprend en outre l'administration d'un inhibiteur de la phosphodiestérase de type 5 (PDE5).

134. Procédé selon la revendication 133, dans lequel l'inhibiteur de PDE5 est le sildénafil.

135. Procédé selon la revendication 133, dans lequel l'EV isolé et l'inhibiteur de la phosphodiestérase de type 5 (PDE5) sont administrés dans des compositions séparées, sensiblement simultanément ou séquentiellement.

136. Procédé selon la revendication 133, dans lequel l'EV isolé et l'inhibiteur de la phosphodiestérase de type 5 (PDE5) sont administrés dans la même composition.

137. Procédé selon la revendication 133, dans lequel l'EV isolé et l'inhibiteur de PDE5 sont administrés en une ou plusieurs doses.

138. Procédé selon la revendication 133, dans lequel l'EV isolé et l'inhibiteur de PDE5 sont administrés à un intervalle de 6 heures, 12 heures, 24 heures, 48 ​​heures, 72 heures, 4 jours, 5 jours, 6 jours ou une fois par semaine.

139. Procédé selon la revendication 133, dans lequel l'EV isolé est administré en 2 doses, 3 doses, 4 doses, 5 doses, 6 doses, 7 doses, 8 doses, 9 doses, 12 doses, 15 doses ou 18 doses 3 doses, 6 doses, 9 doses, 12 doses, 15 doses ou 18 doses, et dans lequel l'inhibiteur de PDE5 est administré en 16 doses, 19 doses, 21 doses, 24 doses, 27 doses, 30 doses, 33 doses, 36 doses, 39 doses, 42 doses, 45 doses, 48 ​​doses, 51 doses, 54 doses, 57 doses, 60 doses, 63 doses ou 66 doses.

140. Procédé selon la revendication 113, dans lequel l'EV isolé est administré une fois par jour pendant 2 jours, pendant 3 jours, pendant 4 jours, pendant 5 jours pendant 6 jours, ou pendant une semaine.

141. Méthode selon la revendication 113, dans laquelle la méthode diminue la pression artérielle pulmonaire systolique (SPAP) chez le sujet.

142. Méthode selon la revendication 113, dans laquelle la méthode augmente la surface alvéolaire du poumon chez le sujet.

143. Méthode selon la revendication 113, dans laquelle la méthode augmente une concentration d'oxygène dans le sang chez le sujet.

144. Méthode selon la revendication 113, dans laquelle la méthode réduit l'inflammation dans le poumon chez le sujet.

145. Procédé selon la revendication 113, dans lequel le procédé réduit le dépôt de matrice extracellulaire dans le fluide de lavage broncho-alvéolaire ou dans le poumon.

146. Procédé selon la revendication 113, dans lequel le procédé améliore l'indice de Fulton.

147. Procédé selon la revendication 113, dans lequel le sujet est un humain, un primate non humain, un chien, un chat, une vache, un mouton, un cheval, un lapin, une souris ou un rat.

148. Procédé selon la revendication 133, dans lequel la PDE5 comprend du sildénafil, du vardénafil, du zapravist, de l'udenafil, du dasantafil, de l'avanafil, du mirodenafil ou du lodenafil.