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Rôle du NaCl dans CTAB - Complexe d'ADN dans l'extraction d'ADN

Rôle du NaCl dans CTAB - Complexe d'ADN dans l'extraction d'ADN



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J'ai une question sur le rôle du NaCl dans le processus d'extraction de l'ADN. Ainsi, pour des concentrations de NaCl inférieures à 0,5 M, les molécules de CTAB et d'ADN peuvent créer des complexes. A ces concentrations, les protéines et autres hydrocarbures sont encore solubles dans l'eau, à l'exception du complexe ADN-CTAB. Si nous augmentons la concentration de NaCl, le complexe CTAB-ADN sera également soluble dans l'eau. Corrigez-moi si je me trompe jusqu'à maintenant.

Donc je ne comprends pas quelque chose. Pourquoi utilise-t-on NaCl ?

Supposons que nous n'ajoutons pas de NaCl. Le CTAB va-t-il créer un complexe avec l'ADN ou non ? Au fur et à mesure que je lis, CTAB crée des liaisons ioniques avec l'ADN (groupes phosphate). Donc, dans cette situation (sans NaCl), CTAB doit également être capable de créer un complexe avec l'ADN.

Alors pourquoi avons-nous utilisé NaCl ? Juste pour garder les protéines et autres hydrocarbures solubles dans l'eau ou y a-t-il autre chose que NaCl aide dans cette création complexe ?


CTAB forme des complexes insolubles avec les acides nucléiques et peut être utilisé pour les précipiter sélectivement à partir de solutions, voir cette référence :

Lorsque vous ajoutez du NaCl à une concentration comprise entre 0,4 et 0,7 M, les acides nucléiques restent en solution, contrairement aux polysaccharides et autres substances susceptibles d'interférer avec la préparation de l'ADN. Voir cet article : « Isolation rapide de l'ADN végétal de haut poids moléculaire. »


Quel est le but du sel dans l'extraction d'ADN?

Pendant l'extraction de l'acide désoxyribonucléique, ou ADN, des composés salins tels que l'acétate de sodium et l'acétate d'ammonium sont typiquement ajoutés pour aider à l'élimination des protéines associées à l'ADN. Un autre type de composé de sel appelé chlorure de sodium, ou NaCl, aide à solidifier et à rendre l'ADN visible. Lorsqu'il est mélangé dans une solution d'alcool, le composant de sodium de NaCl fournit une barrière protectrice autour des extrémités de phosphate d'ADN chargées négativement, leur permettant de se rapprocher pour être extraites de la solution.

L'extraction d'ADN est le processus d'obtention d'ADN pur à partir d'un échantillon, soit à partir de cellules vivantes ou non vivantes, telles que celles trouvées dans les virus. Cette technique est couramment utilisée dans le domaine médical, où la détection précoce des maladies et des troubles augmente considérablement les taux de survie des personnes atteintes.

La méthode nécessite initialement la lyse des cellules qui contiennent l'ADN à extraire. Les cellules se désintègrent en soumettant l'échantillon à des oscillations ultrasonores ou par battage de billes. L'échantillon est additionné de sel, qui est centrifugé dans une solution de phénol-chloroforme. Les molécules de protéines associées sont ensuite extraites. L'ADN qui reste après l'élimination des protéines est mélangé avec une solution d'alcool, généralement de l'isopropanol froid ou de l'éthanol. La solution est centrifugée et l'ADN, qui ne se dissout pas dans l'alcool, est précipité et extrait. Pour augmenter le rendement en ADN, l'ensemble du processus doit être effectué dans un environnement froid.


Qu'est-ce que la précipitation de l'ADN ?

La précipitation de l'ADN est un processus dans lequel l'ADN est précipité ou agrégé dans le fil de coton visible comme des précipités à l'aide d'alcool et de sel.

La précipitation de l'ADN élimine également les impuretés de l'ADN.

« La précipitation est un processus dans lequel la réaction entre le soluté et le solvant crée un agrégat insoluble appelé précipité et le processus est appelé précipitation.

L'ADN est de nature hydrophile qui se dissout dans l'eau mais pas dans l'alcool.

L'eau a une charge positive partielle et une charge négative partielle. La charge positive de la molécule d'eau interagit avec la charge négative de l'ADN (le PO3-) et la dissout. Cependant, l'interaction n'est pas si forte.

L'image montre l'interaction intermoléculaire entre l'eau et l'ADN.

Le sel et l'alcool rendent l'ADN plus hydrophobe, une fois que nous ajoutons le sel dans l'ADN, la charge négative de l'ADN interagit avec la charge positive du sel, au lieu de la charge positive de l'eau.

Il peut se lier à l'eau, mais grâce à l'alcool, l'alcool à constante diélectrique inférieure protège le sel et le complexe d'ADN en le protégeant de l'eau.

L'ADN est visible comme un fil de coton et s'agrège sous forme de précipité en raison de cette réaction chimique.

Pour une explication plus approfondie sur le mécanisme de la précipitation de l'ADN, veuillez lire notre article précédent : Rôle de l'alcool dans l'extraction de l'ADN.

De plus, au lieu de la charge négative de l'ADN, l'eau reste occupée en interaction avec la charge négative de l'alcool qui augmente également l'efficacité de précipitation et le rendement global du précipité d'ADN.

Tout le mécanisme de précipitation est basé sur la polarité de la solution et la constante diélectrique du solvant.


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Défis lors de l'extraction d'ADN et des applications en aval

L'authentification des aliments nécessite un ADN de haute qualité, car il est vital pour l'analyse basée sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR). La faible qualité de l'ADN extrait des produits alimentaires suite à un traitement thermique massif, obstrue le processus d'authentification (Demirhan, Ulca, & Senyuva, 2012). Le choix d'une méthode appropriée pour l'extraction de l'ADN prend en compte certains facteurs, tels que le temps, le coût et la toxicité des produits chimiques utilisés (Chapela et al., 2007). Par exemple, une méthode conventionnelle d'extraction d'ADN d'espèces animales nécessite généralement l'ajout de phénol et de chloroforme (Lopera-Barrero et al., 2008 ), qui présentent des risques plus élevés de contamination de l'ADN et de risques pour la santé (Yue & Orban, 2001 ). La méthode est également chronophage.

Pour assurer une amplification PCR réussie, la pureté de l'ADN extrait est plus importante que le rendement en ADN (Särkinen, Staats, Richardson, Cowan, & Bakker, 2012). Pinto et al. ( 2007 ) ont décrit la présence d'inhibiteurs ou de contaminants provenant d'aliments, tels que les polysaccharides et l'acide humique, tandis que Rijpens, Jannes, Asbroeck, Rossau et Herman ( 1996 ) indiquent que les protéines dans le lait réduisent la solubilité des cellules granulées à partir desquelles l'ADN est extrait. Wilson ( 1997 ) a signalé des lipides et des composés phénoliques susceptibles de contaminer l'ADN. De plus, certains constituants chimiques utilisés lors de l'extraction de l'ADN ont été identifiés comme des inhibiteurs de la PCR. Par exemple, l'agent chélatant, l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), peut former un complexe avec le magnésium, ce qui affecte finalement la concentration efficace de magnésium requise pour la PCR. En conséquence, une concentration accrue de magnésium est nécessaire pour soutenir l'amplification (Khosravinia & Ramesha, 2007).

De plus, les produits chimiques, tels que le phénol, provoquent la dénaturation de la polymérase, tandis que le NaOH provoque également la dégradation de l'ADN et de la polymérase. L'utilisation d'isopropanol et d'éthanol dans l'étape de précipitation de l'ADN affecte la qualité de l'ADN obtenu (Bar, Kubista, & Tichopad, 2012 Hedman & Rådström, 2013). Ces inhibiteurs entraveront et interféreront avec les applications en aval ou ils peuvent provoquer une inhibition complète de l'activité de l'ADN polymérase en PCR (Pinto et al., 2007). Alternativement, les inhibiteurs de PCR peuvent être éliminés par la technique de la colonne de centrifugation, où à l'aide d'agents chaotropes, l'ADN se lie aux membranes de silice pendant l'extraction (Pinto, Forte, Conversano et Tantillo, 2005).

Outre les inhibiteurs, l'augmentation des températures et la durée du traitement thermique peuvent progressivement dégrader la taille des fragments d'ADN (Şakalar, Abasiyanik, Bektik, & Tayyrov, 2012). De même, plusieurs facteurs, tels que la spécificité de l'amorce, la taille de l'amplicon et le nombre de copies du gène, doivent être pris en compte pour une amplification réussie (Jagadeesan & Salem, 2017). Par conséquent, l'incorporation d'un contrôle endogène dans les applications en aval est importante, car elle peut vérifier les variations d'amplification potentielles dues à certains facteurs. Ces facteurs, qui peuvent affecter le résultat du test, comprennent la variation de la quantité et de la qualité de l'ADN extrait des échantillons et la dégradation de l'ADN (Soares, Amaral, Oliveira et Mafra, 2013).


Matériaux et méthodes

Sources de graines de soja

Cinq types de graines de soja, y compris des variétés non biotechnologiques et biotechnologiques, ont été utilisées dans la présente étude. Les semences de soja non biotechnologiques, Zhoudou22, Zheng196 et Zhonghuang13, ont été achetées à l'Académie des sciences agricoles du Henan. Deux types de graines de soja GM ont été obtenues auprès du Henan Sunshine Oils and Fats Group qui importe chaque année des matières GM d'Amérique. Un test d'immunochromatographie sur bandelettes de test a été effectué et a révélé que la 5-énolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) était positive pour les deux graines de soja GM. Étant donné que les échantillons de soja GM étaient géographiquement différents, nous les avons nommés respectivement Roundup Ready Soybean (RRS) 1 (RRS1) et Roundup Ready Soybean2 (RRS2).

Protocoles d'extraction d'ADN génomique

Toutes les graines de soja ont été broyées et homogénéisées dans de l'azote liquide avec un broyeur mélangeur, puis filtrées à travers un tamis de 80 mesh. Tous les échantillons broyés ont été conservés à -20°C avant l'extraction de l'ADN.

FDS méthode 1

Cent milligrammes de Zhoudou22 ont été pesés et transférés dans un tube à centrifuger stérile de 2 ml. Un millilitre de tampon d'extraction SDS (20 g SDS/l, 150 mM NaCl, 100 mM Tris/HCl, 25 mM EDTA, pH 8,0) préchauffé à 65°C a été ajouté et mélangé suivi par l'ajout de 10 l de protéinase K (10 mg/ ml). Ensuite, le tube de réaction a été incubé à 65°C pendant 1 h, sous agitation toutes les 10 min. Après centrifugation du tube pendant 10 min à 12000×g, le surnageant a été extrait deux fois avec du phénol/chloroforme/alcool isoamylique (P : C : I, 25 : 24 : 1, v/v/v) (première extraction) et du chloroforme/alcool isoamylique (C : I, 24 : 1, v/v) (deuxième extraction), respectivement. Ensuite, la phase aqueuse supérieure a été ajoutée avec 0,1 volume de solution d'acétate de potassium (3 M, pH 5,5) et un double volume de solution d'éthanol (95%, v/v, -20°C) (première précipitation), suivi d'une inversion douce et d'un vortex. pendant 10 min à 15000×g pour culotter l'ADN. Après avoir lavé le culot avec une solution d'éthanol (70 %, v/v, -20°C) deux fois et séché à l'air pendant 5 min, le culot séché a été dissous avec 400 pi de tampon Tris/EDTA (10 mM Tris, 1 mM EDTA). Dix milligrammes de RNase ont été ajoutés au mélange et une incubation à 37°C pendant 30 min a été réalisée pour éliminer l'ARN restant. Une autre extraction avec C:I (troisième extraction) a été réalisée pour éliminer la protéine de la solution d'ADN. La récupération de la couche supérieure dans un nouveau tube stérile contenant 2,5 volumes d'éthanol (seconde précipitation) aiderait à précipiter l'ADN facilement. Après filage du tube à 15000×g pendant 10 min et en lavant le culot d'ADN deux fois, l'ADN séché a été redissous dans 200 ul d'eau déminéralisée stérile.

Méthode CTAB

Le fonctionnement de cette méthode était similaire à celui décrit dans la méthode SDS 1, à l'exception du tampon de lyse et des réactifs organiques utilisés pour précipiter l'ADN. Cette méthode était basée sur un tampon d'extraction CTAB (20 g CTAB/l, 1,4 M NaCl, 100 mM Tris/HCl, 20 mM EDTA, pH 8,0) et 0,6 vol d'isopropanol a été ajouté à la phase aqueuse supérieure pour culotter l'ADN deux fois au lieu de solution d'éthanol utilisée dans la méthode SDS 1.

Méthode du mini kit d'usine DP305 et DNeasy

Concernant deux kits commerciaux, DP305 (TIANGEN, Pékin, Chine) et DNeasy Plant Mini kit (Qiagen, Hilden, Allemagne), l'ADN a été extrait de Zhoudou22 selon les instructions du fabricant.

FDS méthode 2

Le protocole d'extraction d'ADN a été décrit dans la méthode SDS 1 à l'exception des composants du tampon de lyse. Les concentrations de chaque composant dans le tampon d'extraction SDS sont détaillées dans le tableau 2.

Composition des composants du tampon de lyse SDS (pH 8,0) .
Nombre . FDS (p/v) . NaCl (mM). Tris/HCl (mM) . EDTA (mM) .
1 0.5% 250 100 25
2 2% 250 100 25
3 5% 250 100 25
4 2% 0 100 25
5 2% 150 100 25
6 2% 250 100 25
7 2% 500 100 25
8 2% 250 10 25
9 2% 250 50 25
10 2% 250 100 25
11 2% 250 200 25
12 2% 250 100 5
13 2% 250 100 25
14 2% 250 100 50
15 2% 250 100 100
Composition des composants du tampon de lyse SDS (pH 8,0) .
Nombre . FDS (p/v) . NaCl (mM). Tris/HCl (mM) . EDTA (mM) .
1 0.5% 250 100 25
2 2% 250 100 25
3 5% 250 100 25
4 2% 0 100 25
5 2% 150 100 25
6 2% 250 100 25
7 2% 500 100 25
8 2% 250 10 25
9 2% 250 50 25
10 2% 250 100 25
11 2% 250 200 25
12 2% 250 100 5
13 2% 250 100 25
14 2% 250 100 50
15 2% 250 100 100
Réactifs organiques utilisés pour extraire et précipiter l'ADN.
Procédure. Première extraction. Troisième extraction. Premières précipitations. Deuxième précipitation.
UNE P : C : Je C : je Éthanol Éthanol
B C : je C : je Éthanol Éthanol
C P : C : Je / Éthanol Ééthanol
P : C : Je C : je KAc + 95% Ethanol Éthanol
E P : C : Je C : je Isopropanol Éthanol
F C : je C : je Éthanol Isopropanol
g C : je C : je Isopropanol Isopropanol
H C : je C : je Isopropanol Éthanol
Réactifs organiques utilisés pour extraire et précipiter l'ADN.
Procédure. Première extraction. Troisième extraction. Premières précipitations. Deuxième précipitation.
UNE P : C : Je C : je Éthanol Éthanol
B C : je C : je Éthanol Éthanol
C P : C : Je / Éthanol Ééthanol
P : C : Je C : je KAc + 95% Ethanol Éthanol
E P : C : Je C : je Isopropanol Éthanol
F C : je C : je Éthanol Isopropanol
g C : je C : je Isopropanol Isopropanol
H C : je C : je Isopropanol Éthanol

FDS méthode 3

Le protocole d'extraction d'ADN a été décrit dans la méthode SDS 1 à l'exception des variétés de solvants organiques. L'utilisation de solvants organiques a été montrée dans le tableau 2. Le volume d'addition d'isopropanol était de 0,6 vol de surnageant.

Méthode FDS 4

C'était la méthode d'extraction d'ADN optimisée. Son protocole a été présenté dans la méthode SDS 1 à l'exception de plusieurs modifications : tampon de lyse SDS (2% SDS (w/v), 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0), premier réactif d'extraction (C : I ), troisième réactif d'extraction (C : I), premier réactif de précipitation (isopropanol), deuxième réactif de précipitation (éthanol).


Réactifs utilisés pour l'isolement et la purification de l'ADN

Nous avons récemment fait une expérience sur l'isolement et la purification de l'ADN à partir de cellules bactériennes et aussi dur que j'essaie, je ne comprends vraiment pas ce qui s'est passé à la suite de quel réactif ? J'ai regardé en ligne et dans plusieurs textes, mais presque chaque source donne une réponse différente.

Ce que nous avons utilisé (par ordre d'utilisation) :
Tampon TE
FDS
Protéinase K
NaCl
Solution CTAB/NaCl
Chloroforme/alcool isoamylique 24:1
Phénol/chloroforme/alcool isoamylique 25:24:1
Isopropanol
Éthanol

Le SDS lyse les cellules
La protéinase K inactive les nucléases
NaCl neutralise les charges sur l'ADN
Le phénol/chloroforme/isoamyle se sépare en phases et élimine la saleté
L'isopropanol précipite l'ADN
L'éthanol élimine le sel

Le reste, je suis tellement confus.

Il s'agit de l'un des nombreux protocoles d'isolement de l'ADN génomique, bien que vous nous laissiez un peu de conjecture quant au protocole exact ! Ce type de méthode est également parfois modifié pour être utilisé dans des minipréparations d'ADN plasmidique. Le SDS, un tensioactif anionique (souvent présent dans de nombreux produits de nettoyage comme le shampooing capillaire), lyse les bactéries. Dans les minipreps d'ADN de plasmide à lyse alcaline, le SDS est souvent utilisé en conjonction avec NaOH (par exemple, 0,2 N) après une digestion enzymatique par le lysozyme, et vous n'auriez généralement pas d'étape de protéinase K. La PK est plus souvent utilisée avec l'isolement de l'ADN génomique (sans lyse alcaline) ou même après une digestion par une enzyme de restriction. Ainsi, la protéinase K inactivera les nucléases (par exemple, les DNases/RNases) en particulier en présence de SDS, mais il s'agit d'une protéase à large spectre qui digère également les protéines pour assurer une lyse complète des cellules.

Le CTAB (bromure de cétyltriméthylammonium) est un tensioactif cationique qui solubilise davantage les cellules. En général, l'ADN est « heureux » dans le NaCl - les ions Na+ neutralisent les phosphates chargés négativement sur l'ADN et facilitent la réunion des molécules d'ADN (les molécules sont moins hydrophiles). Une concentration élevée de NaCl est nécessaire, sinon des précipités d'acides nucléiques CTAB peuvent se former - ce que vous essayez de faire ici est d'éliminer tous les déchets (débris de la paroi cellulaire bactérienne, protéines dénaturées, polysaccharides) complexés avec CTAB et laisser l'ADN bactérien en solution. L'extraction chloroforme/IAA (avec microfuging) laisse ces complexes dans une interface blanchâtre (chloroforme en bas, ADN en haut IAA permet de stabiliser l'interface). L'ADN est « nettoyé » avec du phénol/chloroforme/IAA pour éliminer tous les complexes restants et est précipité du surnageant avec de l'isopropanol (le gros ADN chromosomique est facilement précipité avec cet alcool non polaire, même sans l'ajout de sel supplémentaire ou en utilisant des températures basses). Le culot est lavé avec EtOH (habituellement mais pas toujours 70-75%) pour éliminer tout isopropanol restant et sels résiduels.


Résumé

Différentes espèces de Cannelle sont riches en polysaccharides et en métabolites secondaires, qui entravent le processus d'extraction de l'ADN. Un ADN de haute qualité est la condition préalable à toute étude de biologie moléculaire. Dans cet article, nous rapportons une méthode modifiée pour la qualité et la quantité d'extraction d'ADN à partir d'échantillons de feuilles lyophilisées et non lyophilisées. Le protocole rapporté diffère de la procédure CTAB par l'ajout d'une concentration plus élevée de sel et de charbon activé pour éliminer les polysaccharides et les polyphénols. La grande utilité du protocole modifié a été prouvée par l'extraction d'ADN de différentes espèces ligneuses et 4 Cannelle espèce. Par conséquent, ce protocole a également été validé dans différentes espèces de plantes contenant des niveaux élevés de polyphénols et de polysaccharides. L'ADN extrait a montré une amplification parfaite lorsqu'il a été soumis à une RAPD, une digestion de restriction et une amplification avec des amorces de codage à barres d'ADN. Le protocole d'extraction d'ADN est reproductible et peut être appliqué pour toute étude de biologie moléculaire végétale.


Extraction brute d'ADN

Objectif: Comprendre la procédure d'extraction d'ADN à l'aide de matériel ménager.

introduction: Comment l'enquêteur sur les lieux du crime identifie-t-il le suspect d'une affaire de meurtre ? Comment le pêcheur détecte-t-il une maladie virale qui provoque une épidémie dans ses étangs ? Comment votre sang révèle-t-il aux gens qui sont vos parents ? Comment le scientifique découvre-t-il le gène de résistance à la sécheresse chez les plantes ? Ces réponses peuvent être trouvées dans le travail sur le terrain de la technologie de l'ADN.

  1. Extraction, pour séparer l'ADN de la cellule. Cette étape utilise généralement SDS/CTAB/Triton-X comme détergent actif et NaCl saturé
  2. Purification, pour séparer l'ADN extrait de tout contaminant, débris cellulaires, protéines et ARN. Les scientifiques utilisent le phénol:chloroforme:isoamyléthanol (PCIA) à cette fin et
  3. Précipitation, pour précipiter l'ADN pour former des brins minces, transparents ou blancs. De l'éthanol glacé à 96 % peut être utilisé à ce stade.
  1. Broyer 0,5 gramme d'échantillon dans le mortier stérile et homogénéiser avec la solution tampon,
  2. Filtrer l'homogénat à l'aide de papier filtre et mettre dans la centrifugeuse stérile.
  3. Mélanger le filtrat avec 5 ml de SDS 20 % et 5 ml de NaCl 5 M à l'aide d'un vortex.
  4. Centrifuger la suspension pour séparer les composants cellulaires des débris cellulaires.
  5. Retirer le surnageant dans un nouveau tube.

Ajouter avec précaution de l'éthanol à 96 % glacé dans le nouveau tube par le côté du tube. Des brins blancs apparaîtront sur la surface de la suspension si vous effectuez correctement l'extraction de l'ADN.


Comparaison des méthodes d'extraction de l'ADN total pour la communauté microbienne des sols pollués ☆

L'isolement de l'ADN représente l'étape fondamentale et probablement la plus importante de la biologie moléculaire pour les souches microbiennes, et plus encore, pour les analyses de communautés microbiennes. Malgré le développement de protocoles moléculaires pour l'isolement de la communauté microbienne de l'ADN, il existe encore de nombreux inconvénients dépendants de la composition des échantillons, et même les kits d'isolement génomique disponibles dans le commerce ont des limitations importantes dans la récupération de quantités élevées d'ADN génomique, en particulier à partir d'échantillons de sol. Notre étude vise à comparer et à optimiser un protocole d'isolement de l'ADN d'une communauté microbienne totale à partir d'échantillons de sol pollué, en estimant la quantité et la pureté de l'ADN génomique par g de sol, en fonction des exigences de temps pour chaque protocole, en tenant compte du fait que nos échantillons de sol ont un teneur élevée en acides humiques. Nous avons vérifié plusieurs protocoles d'extraction d'ADN total, basés sur CTAB, y compris un kit spécifique pour le kit d'isolement d'ADN du sol NorgenBiotek. Nous avons estimé le temps nécessaire à chaque protocole, la quantité d'ADN par gramme de sol pollué, le degré de contamination des protéines et des ARN, par analyse spectrophotométrique, mais aussi le degré d'inhibition de l'amplification PCR. La méthode la plus efficace pour nos échantillons de sol à haute teneur en acide humique, adaptée à d'autres analyses moléculaires, était l'échantillon de communauté microbienne d'ADN total extrait de Sagova et al. (2008) basé sur le protocole, avec plusieurs ajustements. Ce protocole sera précieux pour l'analyse moléculaire sur le profilage de la communauté microbienne à partir d'échantillons environnementaux, en particulier de sols pollués.


Voir la vidéo: Étapes de lextraction dADN et PCR (Août 2022).