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Protéine A-anticorps SDS-PAGE

Protéine A-anticorps SDS-PAGE


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Je voulais savoir si l'ébullition du complexe protéine A-anticorps pour l'analyse SDS-PAGE perturberait l'interaction ? et entraîner la dissociation de la protéine A et de l'anticorps ?

Merci


Oui. Les échantillons pour SDS-PAGE sont mélangés avec un tampon de charge contenant du SDS (la concentration finale de SDS est généralement de 2 %). Généralement, le SDS perturbera les interactions protéine-protéine, même avant l'ébullition. Un agent réducteur (généralement du DTT ou du b-mercaptoéthanol) est ajouté pour rompre les liaisons disulfure. Voir schéma ici.

Il y a cependant des exceptions. Certains complexes/multimères protéiques sont résistants au SDS jusqu'à ébullition, et certains maintiennent même des interactions après ébullition. Quelques exemples : Xia et al 2007, Kubista et al 2004, Grigorian et al 2009.


Le dodécyl sulfate de sodium enrobe les protéines proportionnellement à leur poids moléculaire et confère ensuite la même charge électrique négative à toutes les protéines de l'échantillon. La vitesse de migration d'un polypeptide en SDS-PAGE est inversement proportionnelle au logarithme de son poids moléculaire. Cela signifie que plus le polypeptide est gros, plus il migre lentement dans un gel. Le poids moléculaire est déterminé en comparant la migration des spots de protéines à la migration des standards. Les graphiques du poids moléculaire logarithmique en fonction de la distance de migration sont raisonnablement linéaires.

Les protéines séparées par SDS-PAGE sont souvent récupérées dans une procédure qui consiste à localiser la protéine d'intérêt sur le gel après SDS-PAGE, à éluer la protéine du gel, à éliminer le dodécyl sulfate de sodium de l'échantillon élué, et enfin à renaturer la protéine pour une analyse ultérieure. Les protéines éluées des gels sont utilisées avec succès dans diverses applications en aval, telles que la chimie des protéines, la détermination de la composition en acides aminés, l'identification de polypeptides qui correspondent à une activité enzymatique spécifique et à d'autres fins.

L'analyse des concentrations de protéines est un test important dans la recherche en biochimie. Le dosage de Bradford est l'une des méthodes les plus largement utilisées pour déterminer les concentrations de protéines par rapport à un standard. La technique est basée sur la formation d'un complexe entre les protéines en solution et le colorant. Ce test est recommandé pour une utilisation globale, en particulier pour évaluer les concentrations de protéines pour l'électrophorèse sur gel. Les protéines séparées par SDS-PAGE sont souvent récupérées dans une procédure qui implique de localiser la protéine d'intérêt sur le gel après SDS-PAGE, en éluant la protéine du gel, en éliminant le dodécyl sulfate de sodium de l'échantillon élué, et enfin en renaturant la protéine pour une analyse ultérieure.

Les protéines éluées des gels sont utilisées avec succès dans diverses applications en aval, telles que la chimie des protéines, la détermination de la composition en acides aminés, l'identification de polypeptides qui correspondent à une activité enzymatique spécifique et à d'autres fins. L'analyse des concentrations de protéines est un test important dans la recherche en biochimie. Le dosage de Bradford est l'une des méthodes les plus largement utilisées pour déterminer les concentrations de protéines, par rapport à un standard. La technique est basée sur la formation d'un complexe entre des protéines en solution et le colorant Brilliant Blue G.

Ce test est recommandé pour une utilisation globale, en particulier pour évaluer les concentrations de protéines pour l'électrophorèse sur gel. Il est basé sur des observations indiquant que l'absorbance est maximale pour les mélanges acides de bleu brillant de Coomassie G-250 qui passent de 465 nm à 595 nm à un moment où la liaison aux protéines se produit. Le dosage est efficace car le coefficient d'extermination de la solution de complexe albumine-colorant est généralement constant sur une plage de concentration 10 fois supérieure (Westermeier, Naven & Ho?pker, 2008).

Le colorant réagit principalement avec les résidus d'arginine mais moins avec les résidus d'histidine, de lysine, de tryptophane, de tyrosine et de phénylalanine. Apparemment, cet examen n'est pas tout à fait parfait pour les protéines acides ou basiques. Cependant, il est quelque peu sensible à l'albumine de sérum bovin, encore plus que la plupart des protéines, d'un facteur deux. La gammaglobuline (IgG) est la protéine standard de préférence. L'objectif de ce


Électrophorèse sur gel de polyacrylamide

Polyacrylamide L'électrophorèse sur gel (PAGE) est probablement la technique analytique la plus couramment utilisée pour séparer et caractériser les protéines. Une solution de acrylamide et le bisacrylamide est polymérisé. L'acrylamide seul forme des polymères linéaires. Le bisacrylamide introduit des réticulations entre les chaînes polyacrylamides. La « taille des pores » est déterminée par le rapport de l'acrylamide au bisacrylamide et par la concentration en acrylamide. Un rapport élevé de bisacrylamide à acrylamide et une concentration élevée d'acrylamide entraînent une faible mobilité électrophorétique. Polymérisation de l'acrylamide et du bisacrylamide monomères est induite par le persulfate d'ammonium (APS), qui se décompose spontanément pour former des radicaux libres. TEMED, un stabilisant radicalaire, est généralement inclus pour favoriser la polymérisation.

Les gels sont généralement préparés avec la partie supérieure du gel sous les puits d'échantillon rendue moins dense que le reste du gel en dessous qui est intentionnellement rendu plus dense. La partie supérieure est appelée &ldquostacking gel&rdquo et la portion inférieure est appelée &ldquorunning gel&rdquo ou &ldquoseparating gel&rdquo. Le but du gel d'empilement est de concentrer toutes les protéines de différentes tailles dans une zone horizontale compacte en les prenant en sandwich entre un gradient de molécules de glycine au-dessus et d'ions chlorure en dessous. De cette façon, la plupart des protéines entreront simultanément dans le gel de résolution plus dense avant de commencer à migrer vers le bas à des vitesses différentes en fonction de leur taille. De cette façon, les bandes sont beaucoup plus claires et mieux séparées pour la visualisation et l'analyse. Sans le gel d'empilement, les protéines produiront un long frottis à travers le gel de résolution au lieu de bandes distinctes serrées à analyser.

Figure 1. Gel PAGE. Une protéine traverse d'abord le gel d'empilement, où les échantillons s'étalent. Une fois qu'une protéine atteint le gel de séparation, les protéines se regroupent en bandes serrées. Au fur et à mesure qu'ils se déplacent dans le gel de résolution, ils se séparent par taille.

FDS-PAGE

Le dodécyl sulfate de sodium (SDS) est un amphipathique détergent. Il a un groupe de tête anionique et un lipophile queue. Il se lie de manière non covalente aux protéines, où environ une molécule de SDS est attirée par deux acides aminés. Le SDS provoque la dénaturation et la dissociation des protéines les unes des autres (à l'exclusion de la réticulation covalente) et se démêle essentiellement en molécules linéaires. Il confère également une charge négative. En présence de SDS, la charge intrinsèque d'une protéine est masquée. Au cours de la SDS-PAGE, toutes les protéines migrent vers l'anode (l'électrode chargée positivement). Les protéines traitées au SDS ont des rapports charge/masse très similaires et des formes similaires. Au cours de la PAGE, la vitesse de migration des protéines traitées au SDS est effectivement déterminée par leur longueur dépliée, qui est liée à leur poids moléculaire.

Figure 2 : Une protéine entourée par les molécules SDS.


Protocole PAGE FDS :

1. Faites le gel de séparation:

Placez les cadres de coulée (fixez deux plaques de verre dans les cadres de coulée) sur les supports de coulée.

Préparer la solution de gel (comme décrit ci-dessus) dans un petit bécher séparé.

Agiter la solution doucement mais soigneusement.

Pipeter la quantité appropriée de solution de gel de séparation (énumérée ci-dessus) dans l'espace entre les plaques de verre.

Pour que le dessus du gel séparateur soit horizontal, remplissez d'eau (soit de l'isopropanol) dans l'interstice jusqu'à débordement.

Attendre 20-30min pour le laisser gélifier.

Faire le gel d'empilage:

Jetez l'eau et vous pouvez voir le gel de séparation qui reste.

Pipeter dans le gel d'empilage jusqu'à débordement.

Insérez le peigne bien formant sans emprisonner d'air sous les dents. Attendre 20-30min pour le laisser gélifier.

2. Assurez-vous d'une gélification complète du gel d'empilement et sortez le peigne. Retirez les plaques de verre du cadre de coulée et placez-les dans le barrage tampon de la cellule. Versez le tampon de fonctionnement (tampon d'électrophorèse) dans la chambre intérieure et continuez à verser après le débordement jusqu'à ce que la surface du tampon atteigne le niveau requis dans la chambre extérieure.

Mélangez vos échantillons avec le tampon d'échantillon (tampon de chargement).

Faites-les chauffer dans de l'eau bouillante pendant 5 à 10 min.

4. Chargez les échantillons préparés dans les puits et assurez-vous qu'ils ne débordent pas. N'oubliez pas de charger le marqueur de protéine dans la première voie. Ensuite, couvrez le dessus et connectez les anodes.

5. Réglez un volt approprié et lancez l'électrophorèse lorsque tout est terminé.

6. En ce qui concerne le temps d'exécution total, arrêtez l'exécution de SDS-PAGE lorsque le signe le plus bas du marqueur de protéine (si aucun signe visible, renseignez-vous auprès du fabricant) atteint presque la ligne de pied de la plaque de verre. Généralement, environ 1 heure pour une tension de 120V et un gel séparateur à 12%. Pour un gel séparateur possédant un pourcentage plus élevé d'acylamide, le temps sera plus long.

Noter: Divers facteurs affectent les propriétés du gel obtenu.


  • mPAGE ® Western Protein Standards se composent de sept protéines recombinantes à 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 50 kDa, 60 kDa, 80 kDa et 120 kDa avec un site de liaison IgG qui se lie à la plupart des anticorps. Cela permet de visualiser à la fois le marqueur protéique et les protéines de l'échantillon sur le même western blot sans réactifs supplémentaires.
  • Les standards de protéines de couleur mPAGE ® comprennent un mélange de dix protéines pré-colorées hautement purifiées allant de 10 kDa à 203 kDa, couplées de manière covalente avec différents chromophores. Les étalons de protéines de couleur mPAGE ® sont conçus pour observer la séparation des protéines pendant la SDS-PAGE, vérifier l'efficacité du transfert de Western blot sur les membranes et estimer la taille des protéines.
  • Les standards de protéines non colorées mPAGE ® comprennent un mélange de douze protéines recombinantes non colorées allant de 10 kDa à 200 kDa. Les bandes 85 kDa, 25 kDa et 10 kDa ont une intensité plus élevée pour servir de points de référence. Les étalons de protéines mPAGE ® non colorés conviennent à la détermination du poids moléculaire après SDS-PAGE ou Western blot et servent d'étalons pour calibrer la mobilité des marqueurs pré-colorés.


Protéine A-anticorps SDS-PAGE - Biologie

COURBES STANDARD DES PROTÉINES

Comme vous le savez, l'électrophorèse sur gel est un outil puissant pour séparer et visualiser les macromolécules biologiques. Vous avez effectué une électrophorèse sur gel d'agarose pour séparer des fragments d'ADN dans Biologie 151, et très probablement dans d'autres laboratoires également. Les deux prochains laboratoires utiliseront un type d'électrophorèse appelé SDS-PAGE (électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide) qui est utilisé pour séparer des mélanges de protéines.

Dans SDS-PAGE, un détergent, le dodécyl sulfate de sodium (SDS), enrobe les protéines et les polypeptides solubles avec une charge négative trouvée sur la molécule. Les protéines recouvertes de SDS peuvent alors migrer vers l'électrode positive, mais à des vitesses différentes en fonction de leurs tailles relatives. Lorsque les protéines sont chauffées et recouvertes de SDS, elles perdent leur structure tridimensionnelle, ce qui facilite leur migration à travers la matrice de gel. Les polypeptides plus gros sont recouverts de plus de molécules de SDS, de sorte que le rapport entre le poids moléculaire d'une protéine et sa charge est approximativement le même pour toutes les protéines. Cela signifie que la taille (poids moléculaire) devient le déterminant de la mobilité à travers le gel.

Comme vous le savez, de nombreuses grandes protéines multimères sont constituées de sous-unités protéiques plus petites. Ces polypeptides sont maintenus ensemble par un certain nombre de liaisons, y compris des liaisons entre les atomes de soufre dans les acides aminés qu'ils contiennent. La chaleur et le SDS sont utilisés pour briser ces ponts disulfure et libérer les unités polypeptidiques séparées.

En conséquence, une protéine native fonctionnelle peut donner naissance à plusieurs polypeptides plus petits qui peuvent apparaître sous forme de bandes distinctes sur un gel. La myosine, par exemple, est un complexe de 2 chaînes protéiques lourdes et de 4 chaînes légères. Les chaînes légères sont de deux tailles différentes, de sorte qu'un échantillon de myosine purifiée formera 3 bandes distinctes lorsqu'il est traité de manière appropriée avant l'électrophorèse.

Les procédures SDS-PAGE utilisent des gels SDS-PAGE qui sont exécutés dans des chambres d'électrophorèse verticales. Dans ces systèmes, le gel de polyacrylamide est placé dans une chambre remplie de tampon entre deux électrodes. Les échantillons de protéines traités sont placés dans des puits au sommet du gel et les électrodes sont connectées à une alimentation électrique qui génère un gradient de tension à travers le gel. Les protéines chargées négativement et recouvertes de SDS sont alors capables de migrer vers le bas à travers le gel vers l'électrode positive.

La taille des protéines est mesurée en daltons, une mesure du poids moléculaire. Un dalton est défini comme la masse d'un atome d'hydrogène, qui est de 1,66 x 10 24 gramme. La plupart des protéines ont des masses de l'ordre de milliers de daltons, de sorte que le terme kilodalton (kD) est souvent utilisé pour décrire le poids moléculaire des protéines. Étant donné que le poids moyen d'un acide aminé est de 110 daltons, le nombre d'acides aminés dans une protéine peut être approximé à partir de son poids moléculaire.

Les protéines de vos échantillons ne sont pas visibles pendant l'exécution du gel, à moins qu'elles ne soient précolorées avec des colorants liés de manière covalente. Par conséquent, au cours d'un cycle d'électrophorèse typique, vous devriez être en mesure de voir la séparation des étalons de protéines précolorés, mais pas le mouvement des protéines inconnues à l'étude.

Comme dans toute procédure d'électrophorèse, si le courant électrique est laissé allumé trop longtemps, les protéines s'écouleront du gel au fond. Pour éviter cela, un colorant de suivi bleu est mélangé avec les échantillons de protéines des embryons. Ce colorant bleu est chargé négativement et est également attiré vers l'électrode positive. Étant donné que les molécules de colorant sont plus petites que les protéines attendues dans la plupart des échantillons, elles se déplacent plus rapidement à travers le gel.

Il existe généralement une relation linéaire entre le log (base 10) du poids moléculaire d'une protéine et la distance à laquelle le fragment de protéine migre dans le gel. Notez que cette relation linéaire est uniquement entre le log du poids moléculaire et la distance. En raison de cette relation linéaire, nous pouvons générer une équation pour la ligne droite qui décrit le log du poids moléculaire et la distance parcourue.

Ces sortes de courbes sont appelées courbes standard qui peuvent être utilisées pour identifier le poids moléculaire de protéines inconnues. Bien sûr, pour pouvoir le faire, vous devez connaître le poids moléculaire des protéines, c'est pourquoi nous achetons des standards de protéines comme ceux de Bio-Rad ci-dessous.

Tableau des standards de protéines pré-colorés possibles

La procédure pour le laboratoire d'aujourd'hui sera assez simple. Vous effectuerez une électrophorèse quantitative SDS-PAGE d'étalons de protéines et générerez une courbe étalon avec des barres d'erreur. Le point clé est de développer votre technique afin que vous ayez peu de variation dans vos résultats.

1. Votre instructeur vous montrera comment assembler les unités de gel verticales et installer les gels SDS-PAGE préfabriqués. Attention à ne pas trop serrer les pinces à gel

2. Ajoutez du tampon d'électrophorèse et assurez-vous qu'il n'y a pas de fuites dans le système. Réparez les fuites si nécessaire.

3. Chargez autant d'échantillons de 10 ul d'étalons que vous en avez. Cela dépendra du coût des normes et de la quantité disponible.

4. Faites fonctionner les gels pendant environ 45 minutes ou jusqu'à ce que les bandes qui se déplacent le plus rapidement se rapprochent des extrémités du gel.

5. Retirez le gel des plaques sandwich. Placer sur une table lumineuse et lire directement la distance parcourue. Mesurez du fond du puits à l'avant de la bande. Si vous avez des étalons non tachés, vous devrez les teindre. Une procédure de coloration sera fournie si nécessaire, il existe quelques colorations de protéines générales standard qui peuvent être utilisées en fonction de la combinaison de normes dont nous disposons.

6. Les poids moléculaires des étalons vous seront fournis. Utilisez ces poids pour générer une courbe standard avec des barres d'erreur (reportez-vous au laboratoire précédent pour la procédure). Incluez une équation pour la droite de régression. N'oubliez pas de prendre le log base 10 des poids moléculaires lorsque vous faites votre courbe standard.

Les matériaux énumérés ci-dessous sont nécessaires pour effectuer l'expérience d'aujourd'hui. Ils sont utilisés pour la manipulation des échantillons, ainsi que pour la préparation et l'analyse des gels SDS-PAGE.

- Eprouvettes graduées et verre d'eau distillée

- 50 ul/groupe d'étalons de protéines

- Gants, règles en plastique transparent, support tube à essai pour tubes à essai chauds

- Porte-tubes pour les tubes de 0,5 ml

- pipettes, eppendopf et 10 ml, plateaux de coloration en plastique (6" X 6")

- blocs chauds réglés à 95C pour chauffer les échantillons

1. Centre de formation avancée en biologie cellulaire et moléculaire. Une partie du matériel pour le laboratoire d'aujourd'hui provient d'un atelier auquel j'ai assisté sur les « techniques de séparation », le Dr Frank Castora, directeur de l'Université catholique de Washington DC.

2. Davis, L.D., Dibner, M.D. et Battey, J.F. 1986. Méthodes de base en biologie moléculaire. Elsevier, New York. pages 58-75.

3. Gasque, C.E. 1989. Manuel d'expériences de laboratoire en biologie cellulaire. TOILETTES. Éditions Brown, Dubuque, Iowa.

4. Bergman, A. 1990. Investigations de laboratoire en biologie cellulaire et moléculaire. Troisième édition. John Wiley et fils, New York.

5. Hames, B.D. et Rickwood, D. 1988. Électrophorèse sur gel de protéines, une approche pratique. IRL Press, Washington DC.

DÉTERMINATION DU POIDS MOLÉCULAIRE D'UN MÉLANGE DE PROTÉINES INCONNUES

Ainsi, sur la base du laboratoire de la semaine dernière, vous êtes tous familier avec SDS-PAGE et comment faire une courbe standard. Votre tâche cette semaine est de concevoir et de réaliser une expérience pour déterminer le poids moléculaire d'un mélange de protéines inconnues. Votre groupe devra lire ce laboratoire et rencontrer l'instructeur avant ce laboratoire pour présenter votre conception expérimentale. Au cours de ces réunions préparatoires, je poserai généralement au groupe des questions telles que :

1. En termes simples, qu'essayez-vous de faire dans ce laboratoire ?

2. Quelle est votre hypothèse et votre hypothèse nulle ?

3. Quelle est votre matrice de conception expérimentale ? Je veux le voir écrit.

4. Comment allez-vous analyser/quantifier vos données ? Je veux que vous soyez précis.

Pour ce premier laboratoire d'expérimentation, j'allais donner aux groupes d'étudiants un mélange de sang total et vous faire caractériser les protéines plasmatiques présentes, mais il faut vraiment concentrer un peu les protéines sanguines pour obtenir de bons résultats. Au lieu de cela, je vais vous fournir les mêmes matériaux que vous aviez la semaine dernière plus 50 ul d'un mélange inconnu de protéines. Encore une fois, votre travail consiste à concevoir et à réaliser une expérience pour déterminer le poids moléculaire de ces protéines.

Comme le mélange de protéines inconnu n'est pas coloré, vous devrez les visualiser en utilisant la procédure de coloration de Coomassie. Les colorants de Coomassie se lient aux protéines par le biais d'interactions ioniques entre les groupes acide sulfonique de colorant et les groupes amine protéique positifs ainsi que par les attractions de Van der Waals. Il existe un certain nombre de protocoles de coloration qui impliquent tous des variations sur le thème de la coloration, puis de la décoloration du gel. En voici un qui fonctionne plutôt bien :

1. Immerger le gel dans la solution de coloration.

2. Cuire au micro-ondes pendant 30 secondes, je n'ai jamais essayé cela auparavant, mais c'est censé l'accélérer.

3. Placer le gel sur une plate-forme rotative et agiter lentement jusqu'à ce que des bandes deviennent visibles. Prend environ une demi-heure (le micro-ondes est utilisé pour accélérer le processus de coloration).

4. Videz la solution de coloration et conservez-la pour une utilisation future.

5. Rincez le gel plusieurs fois avec de l'eau e-pure.

7. Immerger le gel dans la solution de décoloration.

8. Micro-ondes pendant 30 secondes, encore une fois, je n'ai pas essayé cela auparavant, mais il est logique que cela accélère la procédure.

9. Pliez et placez plusieurs feuilles de Kimwipes au coin du récipient (le papier contient des protéines et se lie à la tache, accélérant ainsi le processus de décoloration).

10. Remettez le gel sur une plate-forme rotative et agitez jusqu'à ce que les bandes deviennent visibles. Cela prend environ une demi-heure. Alternativement, vous pouvez le laisser toute la nuit.

11. Détachez davantage en remplaçant la serviette en papier, si nécessaire. L'idée de la décoloration est que le coommassie tache tout, le gel et les bandes. Vous devez enlever la plus grande partie de la tache du gel afin de pouvoir voir les bandes.

II. MATÉRIAUX Le matériel suivant vous sera fourni :

- solution de coloration au bleu de coommasie, elle peut être constituée en kit, ou être réalisée à partir du mélange ci-dessous

- 50 ul/groupe de mélange de protéines inconnues

- 50 ul/groupe d'étalons de protéines

- Eprouvettes graduées et verre d'eau distillée

- Gants, règles en plastique transparent, support tube à essai pour tubes à essai chauds

- Porte-tubes pour les tubes de 0,5 ml

- pipettes, eppendopf et 10 ml, plateaux de coloration en plastique (6" X 6")

- blocs chauds réglés à 95C pour chauffer les échantillons

Solution de coloration 1 litre :

100 ml d'acide acétique glacial

2,5 g Bleu brillant de Coomassie R-250

Filtrez la solution à travers le filtre Whatman n°1 pour éliminer les impuretés.

Solution de décoloration 1 litre :

50 ml d'acide acétique glacial

2. Centre de formation avancée en biologie cellulaire et moléculaire. Une partie du matériel pour le laboratoire d'aujourd'hui provient d'un atelier auquel j'ai assisté sur les « techniques de séparation », le Dr Frank Castora, directeur de l'Université catholique de Washington DC.

3. Davis, L.D., Dibner, M.D. et Battey, J.F. 1986. Méthodes de base en biologie moléculaire. Elsevier, New York. pages 58-75.

4. Gasque, C.E. 1989. Manuel d'expériences de laboratoire en biologie cellulaire. TOILETTES. Éditions Brown, Dubuque, Iowa.

5. Bergman, A. 1990. Investigations de laboratoire en biologie cellulaire et moléculaire. Troisième édition. John Wiley et fils, New York.

6. Hames, B.D. et Rickwood, D. 1988. Électrophorèse sur gel de protéines, une approche pratique. IRL Press, Washington DC.

NOTES POUR LE PREMIER LABORATOIRE EXPÉRIMENTAL

Lorsque vous concevez votre expérience, tenez compte des éléments suivants. Votre expérience doit être complétée, analysée et un rapport oral et écrit doit être complété avant le laboratoire de la semaine suivante. Le laboratoire numéro 4 consistera en la présentation orale des résultats de votre expérience à la classe. La présentation orale de votre groupe doit prendre le format suivant :

Introduction : contexte de ce que vous avez fait, pourquoi vous avez décidé de le faire, ce que vous espériez accomplir, cela peut inclure une déclaration décrivant votre hypothèse nulle

Méthodes : cela devrait inclure la conception de l'expérience et la manière dont vous avez physiquement effectué votre travail

Résultats : cela devrait inclure une présentation de vos résultats et une discussion sur leur signification, cela devrait inclure des graphiques (overheads) le cas échéant et l'analyse statistique que vous avez utilisée pour donner un certain degré de confiance dans vos résultats

Vous devriez planifier votre présentation en prenant environ 15-20 minutes. Cela permettra environ 10 minutes pour la discussion. Tous les membres doivent participer à la discussion et à la rédaction de l'expérience. Le groupe peut travailler ensemble à la rédaction d'un rapport commun de leur expérience. Votre note dans la composante laboratoire du cours sera déterminée par les facteurs suivants :

2. Qualité de votre présentation orale (voir rubrique)

3. Qualité de votre compte rendu de laboratoire

Les rapports écrits doivent être dactylographiés et utiliser une grammaire appropriée. Vos rapports écrits ne peut pas être simplement une copie papier de votre présentation Powerpoint. Ils doivent inclure tous les graphiques ou analyses statistiques que vous avez utilisés. Voir le premier laboratoire pour un format plus complet pour les comptes rendus de laboratoire. Lorsque votre groupe remet son rapport écrit, il doit être signé par tous les membres du groupe. À côté de vos signatures, vous devriez avoir un pourcentage (0 - 100 %). Ce nombre représente le temps que chaque membre a consacré à la rédaction de l'expérience et à la préparation du rapport oral.

La somme de ces pourcentages doit être égale à 100 %. Idéalement, chaque membre devrait fournir une quantité de travail égale. Par exemple, s'il y a trois personnes dans le groupe, chaque étudiant mettrait idéalement 33,3% du travail dans l'analyse des données et la rédaction de l'expérience et la préparation du rapport oral. Voir le premier document de laboratoire pour le format à utiliser pour les rapports écrits.


Purification des anticorps : chromatographie d'affinité - protéine A et protéine G Sépharose

La chromatographie d'affinité repose sur l'interaction réversible entre une protéine et un ligand spécifique immobilisé dans une matrice chromatographique. L'échantillon est appliqué dans des conditions qui favorisent une liaison spécifique au ligand en raison d'interactions électrostatiques et hydrophobes, des forces de van der Waals et/ou d'une liaison hydrogène. Après avoir éliminé le matériau non lié, la protéine liée est récupérée en changeant les conditions du tampon en celles qui favorisent la désorption. La technique a été utilisée non seulement pour isoler des anticorps spécifiques d'un antigène, mais également pour éliminer des contaminants spécifiques d'échantillons biologiques. Des méthodes sont décrites pour la purification d'immunoglobulines, à savoir IgG, fragments et sous-classes d'IgG, en utilisant la haute affinité de la protéine A et de la protéine G couplées à l'agarose. Dans la sous-rubrique 3, il existe également des protocoles de purification par affinité utilisant un ligand spécifique couplé à des matrices commerciales telles que CNBr-Sepharose 4-B et Affigel.


SDS PAGE également connu sous le nom d'électrophorèse sur gel de sodium dodécyl sulfate-polyacrylamide est une technique utilisée pour séparer les protéines en fonction de leur poids moléculaire. C'est une technique largement utilisée en médecine légale, en génétique, en biotechnologie et en biologie moléculaire pour séparer les molécules de protéines en fonction de leur mobilité électrophorétique.

Principe de la FDS-PAGE

Le principe de la SDS-PAGE stipule qu'une molécule chargée migre vers l'électrode avec le signe opposé lorsqu'elle est placée dans un champ électrique. La séparation aura lieu au fur et à mesure de la mobilité des espèces chargées. Les minuscules molécules ont tendance à se déplacer plus rapidement en raison de leur moindre résistance au moment de l'électrophorèse. La vitesse de migration influence la structure et la charge de la protéine.

Le dodécyl sulfate de sodium et le polyacrylamide aident à éliminer l'influence de la structure et de la charge des protéines, et les protéines sont séparées en fonction de la longueur de la chaîne polypeptidique.

Fonction de SDS dans SDS-PAGE

Le SDS peut être défini comme un détergent présent dans le tampon d'échantillon SDS-PAGE. La fonction du SDS est de rompre les liaisons disulfure des protéines en perturbant la structure tertiaire des protéines ainsi que certains agents réducteurs.

Matériaux nécessaires

Alimentations : Il est utilisé pour convertir le courant alternatif en courant continu.

Gels : Ils sont soit préparés en laboratoire, soit achetés sur le marché.

Chambres d'électrophorèse : Les chambres des gels SDS-PAGE qui s'adaptent bien doivent être utilisées.

Échantillons de protéines : La protéine est dissoute avec un tampon d'échantillon SDS-PAGE et bouillie pendant 10 minutes. Un agent réducteur tel que le dithiothréitol ou le 2-mercaptoéthanol est également ajouté pour minimiser les liaisons disulfure afin d'empêcher tout repliement des protéines tertiaires.

Tampon de fonctionnement : Les échantillons de protéines remplis sur le gel sont analysés dans le tampon de fonctionnement SDS-PAGE.

Tampon de coloration et de décoloration : la solution de coloration de Coomassie est utilisée pour la coloration. Une solution de décoloration est utilisée pour décolorer un gel. Des bandes de protéines peuvent alors être observées à l'œil nu.

Échelle de protéines : une échelle de protéines de référence est utilisée pour localiser la protéine d'intérêt en fonction de la taille moléculaire.

Protocole de SDS-PAGE

Préparation du gel

Tous les réactifs sont combinés, sauf TEMED, pour la préparation du gel.

Lorsque le gel est prêt à être mis, ajoutez TEMED.

Le gel utilisé pour séparer est versé dans la chambre de coulée.

Vous devez mettre du butanol avant la polymérisation pour éliminer les bulles d'air indésirables présentes.

Entre la plaque de verre, le peigne est inséré.

La « cassette de gel » est le gel polymérisé.

Faire bouillir de l'eau dans un bécher.

Ajouter du 2-mercaptoéthanol au tampon de l'échantillon.

Mettez la solution tampon dans des tubes de microcentrifugation et ajoutez-y des échantillons de protéines.

Prenez des marqueurs MW dans des tubes séparés.

Porter les échantillons à ébullition pendant moins de 5 minutes pour dénaturer complètement les protéines.

Électrophorèse

La cassette de gel est retirée du support de coulée et placée séparément dans l'ensemble d'électrodes.

Le support de pince est fixé à l'ensemble d'électrodes.

Un tampon d'électrophorèse 1X est ajouté à l'ouverture du cadre de coulée pour remplir les puits du gel.

Mettre 30 ml de l'échantillon dénaturé dans le puits.

Le réservoir est recouvert d'un couvercle et l'unité est reliée à une alimentation électrique.


Voir la vidéo: How The Immune System ACTUALLY Works IMMUNE (Décembre 2022).