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Combien de protéines liant l'ARN peuvent se lier simultanément à un seul ARNm ?

Combien de protéines liant l'ARN peuvent se lier simultanément à un seul ARNm ?



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En règle générale, combien de protéines de liaison à l'ARN peuvent se lier simultanément à un seul ARNm ? Ou en d'autres termes, combien de « sites de liaison » possède un ARNm ? Quel ordre de grandeur ?

Je m'intéresse aux granules d'ARN comme les granules de stress ou les P-bodies. Ils contiennent, entre autres, de l'ARNm et des protéines de liaison à l'ARN. Je ne suis pas biologiste et je n'ai pas encore rencontré cette information dans la littérature connexe.


Voir ce document. Ils ont étudié les sites protégés par la RBP dans l'ensemble du transcriptome humain par réticulation ARN-protéine suivie d'une digestion et d'un séquençage à la RNAse : PIPseq.

La figure 1 de l'article montre la distribution des sites protégés par les protéines dans les ARN. Ils le corrèlent également avec différentes régions de l'ARNm et son expression.

Ils montrent le nombre de sites protégés par des protéines (PPS) par transcrit, mais ce n'est pas une mesure appropriée à mon avis. Le nombre doit être normalisé avec la longueur de la transcription afin que vous obteniez la densité des sites protégés. À partir de la figure 4 (voir ci-dessous), vous pouvez estimer approximativement que la densité moyenne de PPS est proche de 0,6, ce qui signifie que 60% de tout ARN devrait être lié à une protéine.

Figure 4

Autres points à noter :

  • Les ARNm hautement traduits auront plusieurs ribosomes sur leur CDS et seront probablement plus protégés.
  • Les ARN séquestrés dans les granules de stress auront également une densité élevée de PPS
  • L'empreinte des différents RBP sera différente. Ainsi, le nombre de protéines pouvant se lier à un ARNm différera entre les différentes RBP.

Lectures complémentaires :


La dissection de la spécificité cible de la protéine de liaison à l'ARN COMMENT révèle dpp L'ARNm comme nouvelle cible COMMENT

David Israel, Ronit Nir, Talila Volk Dissection de la spécificité cible de la protéine de liaison à l'ARN COMMENT révèle dpp L'ARNm comme nouvelle cible COMMENT. Développement 1er juin 2007 134 (11) : 2107–2114. doi : https://doi.org/10.1242/dev.001594

La régulation du métabolisme de l'ARN joue un rôle majeur dans le contrôle de l'expression des gènes au cours des processus de développement. Les Drosophile La protéine de liaison à l'ARN Held out wing (COMMENT), régule un éventail de processus de développement dans la croissance embryonnaire et adulte. Nous avons caractérisé la séquence primaire et les exigences structurelles secondaires pour l'élément de réponse HOW (HRE), et montrons que ce site est nécessaire et suffisant pour la liaison HOW. Sur la base de cette analyse, nous avons identifié les Drosophile homologue du TGFβ, dpp, en tant que nouvelle cible directe pour COMMENT la régulation négative dans le disque imaginal de l'aile. La liaison de l'isoforme HOW(L) du répresseur au dppLa région non traduite 3' (UTR) entraîne une réduction de GFP-dppNiveaux de rapporteur 3'UTR dans les cellules S-2, de manière dépendante du site HRE. De plus, la co-expression de HOW(L) dans le disque imaginal de l'aile avec un dpp-GFP construction de fusion a conduit à une réduction des niveaux de DPP-GFP dans un dpp-3′ manière dépendante de l'UTR. Inversement, une réduction des niveaux endogènes de HOW par l'expression ciblée d'ARN double brin spécifique de HOW a conduit à une élévation correspondante de dpp niveau d'ARNm dans le disque imaginal de l'aile. Ainsi, en caractérisant les séquences d'ARN qui se lient COMMENT, nous démontrons un nouvel aspect de régulation, au niveau de l'ARNm, de Drosophile DPP.


MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Statistiques et présentation des données

Pour les expériences impliquant des cellules cultivées, les échantillons générés à partir de puits ou de plaques individuels ont été considérés comme des réplicats biologiques. Pour les expériences sur le poisson zèbre, chaque larve de poisson a été considérée comme un réplicat biologique. Dans la légende de la figure pour chaque expérience, le nombre de réplicats biologiques indépendants et la façon dont les données sont présentées dans la figure (généralement moyenne ± sem) sont clairement indiqués. Valeurs de signification calculées avec des Student non appariés t test sont clairement indiqués dans les chiffres des données. Les données ont été tracées/ajustées et les statistiques générées à l'aide de Prism 7 ou 8 (GraphPad, La Jolla, CA, USA).

Réactifs

Tout le HNE utilisé dans cette étude était du HNE (alcyne) (appelé HNE dans le manuscrit/les figures pour plus de clarté) et a été synthétisé comme indiqué précédemment (37). Sauf indication contraire, tous les autres réactifs chimiques ont été achetés auprès de MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) à la pureté la plus élevée disponible. La tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) provenait de Chem-Impex International (Wood Dale, IL, USA). La puromycine provenait de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). L'actinomycine D provenait de MilliporeSigma. AlamarBlue provenait de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) et a été utilisé conformément aux instructions du fabricant. Le milieu essentiel minimal (MEM), l'Opti-MEM, le PBS de Dulbecco, le pyruvate 100X (100 mM), les acides aminés non essentiels 100X (11140-050) et la streptomycine pénicilline 100X (15140-122) provenaient de Thermo Fisher Scientific. Le cocktail d'inhibiteurs de protéases sans EDTA complet provenait de Roche (Bâle, Suisse). Le peptide 3XFlag provenait d'ApexBio Technology (Houston, TX, USA). La résine anti-drapeau (M2) (A2220) provenait de MilliporeSigma. La résine Talon (635503) provenait de Clontech Laboratories (Mountain View, CA, USA). L'agarose Ni-NTA (30210) provenait de Qiagen (Hilden, Allemagne). Les réactifs de transfection 2020 et LT1 provenaient de Mirus Bio (Madison, WI, USA). DharmaFECT I et Duo provenaient de Dharmacon (Lafeyette, CO, USA). La polyéthylèneimine provenait de Polysciences (Warrington, PA, USA). Le kit de détection de mycoplasmes Venor GeM PCR provenait de MilliporeSigma. Le substrat ECL et le substrat ECL-Plus provenaient de Thermo Fisher Scientific et ont été utilisés conformément aux instructions. L'acrylamide, le persulfate d'ammonium, la tétraméthyléthylènediamine, l'étalon de protéine Precision Plus provenaient de Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Tous les lysats ont été quantifiés en utilisant le dosage des protéines Bio-Rad (Bio-Rad) par rapport à l'albumine sérique bovine (BSA) comme standard (Bio-Rad). La PCR a été réalisée en utilisant Phusion Hot start II (Thermo Fisher Scientific) selon le protocole du fabricant. Tous les inserts plasmidiques ont été validés par séquençage à l'installation principale de séquençage de Cornell Biotechnology (Ithaca, NY, USA). Tout le matériel plastique de culture cellulaire stérile provenait de CellTreat Scientific Products (Pepperell, MA, USA).

Génération de plasmides

Les séquences de toutes les amorces utilisées pour le clonage et la mutagenèse dirigée sont répertoriées dans le tableau supplémentaire S9. Tous les plasmides générés ont été entièrement validés par séquençage Sanger au Cornell Genomics Core Facility.

Drapeau pCS2+83HuR a été généré par amplification PCR de HuR humain (plasmide fourni par le laboratoire Hla), extension du produit résultant et clonage dans le vecteur pCS2+8 linéarisé (plasmide 34931 Addgene, Watertown, MA, USA). Pour l'expression recombinante, la même procédure a été utilisée pour cloner HuR dans un vecteur pET28a.

pLJM60 AUF1 p42 a été obtenu à partir d'Addgene (plasmide 38242) et cloné avec un Flag2 tag dans pCS2+8 comme décrit ci-dessus. En utilisant le plasmide résultant, AUF1 p37 et AUF1 p45 ont été générés par délétion de AUF1-exon 7 et addition de AUF1-exon 2, respectivement. AUF1 p40 a été généré par addition d'AUF1-exon 2 à AUF1 p37. Pour l'expression recombinante, ces constructions ont été clonées dans un vecteur pET28a.

Le plasmide rapporteur de luciférase pSGG (38) contenant le Nrf2 3'-UTR a été obtenu auprès du professeur Qun Zhou (University of Maryland School of Medicine, Baltimore, MD, USA). Ce plasmide a été modifié pour les tests intron-reporter en clonant des fragments du transcrit Nrf2 avec ou sans introns (amplifiés à partir d'ADN génomique ou d'ADNc préparé à partir de cellules HEK293T, respectivement) en amont de la séquence codant pour la luciférase.

Des plasmides d'expression résistants à l'ARN en épingle à cheveux (sh) (pour les expériences de sauvetage) ont été produits par amplification par PCR du plasmide de départ avec des amorces de mutagenèse directe et inverse contenant les mutations souhaitées (tableau supplémentaire S9) suivi d'un traitement DpnI (NEB). Ces plasmides codent pour la même protéine mais contiennent des mésappariements (surlignés en rouge dans les séquences d'amorces du tableau supplémentaire S9) dans la séquence de ciblage du shRNA, permettant l'expression de la protéine ectopique dans les cellules knockdown.

Culture de cellules

HEK293T [obtenu de l'American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA] et des cellules endothéliales embryonnaires de souris (MEEC générées dans le laboratoire Hla) ont été cultivées dans du MEM (51090036 Thermo Fisher Scientific) complété avec 10 % v/v de bovin fœtal sérum (FBS MilliporeSigma), pénicilline/streptomycine (Thermo Fisher Scientific), pyruvate de sodium (Thermo Fisher Scientific) et acides aminés non essentiels (Thermo Fisher Scientific) à 37°C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2. Le milieu a été changé tous les 2-3 jours.

Génération de lignées cellulaires knockdown à base de shRNA

Les cellules d'encapsidation HEK293T (5,5 X 10 5 cellules) ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits dans un milieu sans antibiotique et incubées pendant 24 h. Les cellules ont été transfectées avec un mélange de 500 ng de plasmide d'encapsidation (pCMV-R8.74psPAX2), 50 ng de plasmide d'enveloppe (pCMV-VSV-G) et 500 ng de vecteur pLKO contenant la séquence en épingle à cheveux (MilliporeSigma Supplemental Table S2) en utilisant TransIT-LT1 (Mirus Bio) suivant le protocole du fabricant. Le plasmide shControl a été obtenu auprès du professeur Andrew Grimson (Cornell University). Dix-huit heures après la transfection, le milieu a été remplacé par un milieu contenant 20 % de FBS et incubé pendant 24 h supplémentaires. Le milieu contenant des particules virales a été récolté, centrifugé (800 g, 10 min), filtrée à travers un filtre de 0,45 µm et utilisée pour l'infection ou congelée à -80°C pour une utilisation ultérieure.

Des cellules HEK293T ou MEEC (5,5 X 10 6 cellules) en plaques 6 puits ont été traitées avec 1 ml de milieu contenant le virus dans un volume total de 6 ml de milieu contenant 8 µg/ml de polybrène (MilliporeSigma). Après 24h, le milieu a été changé et les cellules ont été incubées pendant 24h. Après cette période, le milieu a été remplacé par un milieu contenant 2 ug/ml de puromycine (Santa Cruz Biotechnology). Après la sélection, les cellules ont été analysées par Western blot.

Séquençage d'ARN

Après traitement des cellules shHuR/shControl avec HNE (50 M) ou H2O2 (225 µM) pendant 18 h, les cellules ont été lysées par ajout de Trizol (Thermo Fisher Scientific), et l'ARN a été isolé selon le protocole du fabricant. La qualité de l'ARN a été évaluée par spectrophotométrie Nanodrop (rapport A260/A280

2) et analyse de fragments à l'aide d'un Bioanalyseur (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Les nombres de qualité d'ARN pour tous les échantillons étaient de 10,0. Le reste de la procédure, y compris l'analyse des données, a été effectuée par le service central de séquençage de l'ARN de l'Université Cornell. En bref, l'ARNr a été soustrait par hybridation d'échantillons d'ARN total (100 ng d'entrée d'ARN total) en utilisant le kit RiboZero Magnetic Gold H/M/R (Illumina, San Diego, CA, USA). Après nettoyage par précipitation, les échantillons soustraits d'ARNr ont été quantifiés avec un Qubit 2.0 (kit ARN HS Thermo Fisher Scientific). Des bibliothèques d'ARN-seq à code-barres TruSeq ont été générées à partir de la moitié des échantillons d'ARNr soustraits avec le kit de préparation de bibliothèque d'ARN directionnel NEBNext Ultra II (New England Biolabs, Ipswich, MA, États-Unis). Chaque bibliothèque a été quantifiée avec un Qubit 2.0 (kit dsDNA HS Thermo Fisher Scientific), et la distribution des tailles a été déterminée avec un analyseur de fragments (Agilent Technologies) avant le regroupement. Les bibliothèques ont été séquencées sur un instrument NextSeq500 (Illumina). Au moins 60 millions de lectures asymétriques de 75 pb ont été générées par bibliothèque. Les lectures ont été coupées pour les séquences d'adaptateur et de faible qualité avec cutadapt v.1.8 [paramètres : -m50 -q20 -a 5'-AGATCGGAAGAGCACACACGTCTGAACT-CCAGTC-3' -match-read-wildcards ( 39 )]. Les lectures coupées ont été mappées sur des séquences d'ARNr avec bowtie2 v.2.2 pour les supprimer [paramètres : options de mappage par défaut, -al et -un pour séparer les lectures correspondantes et non correspondantes (40)]. Les lectures ont été mappées sur le génome/transcriptome de référence (GRCh37/hg19) à l'aide de tophat v.2.1 [paramètres : -library-type = fr-firststrand -no-novel-juncs -G < ref_genes.gtf > ( 41 )]. Cufflinks v.2.2 (cuffnorm/cuffdiff) a été utilisé pour générer des fragments par kilobase de transcrit par million de lectures cartographiées (FPKM) et une analyse statistique de l'expression différentielle des gènes (42). Les données de séquençage d'ARN ont été soumises à Gene Expression Omnibus (numéro d'accès GEO GSE127444).

Essais d'inhibition de la croissance

Des cellules HEK293T (4000 cellules/puits) ont été ensemencées dans des plaques 96 puits. Après 24 h, les cellules ont été traitées avec les molécules indiquées aux concentrations indiquées et incubées pendant 48 h. AlamarBlue (Thermo Fisher Scientific) a été ajouté à chaque puits, et les cellules ont été incubées pendant 3 h supplémentaires, après quoi la fluorescence (excitation 560 nm émission 590 nm) a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques BioTek Cytation 3 (BioTek, Winooski, VT, ETATS-UNIS). Pour tester si l'alamarBlue réduit est oxydé par H2O2 sur les échelles de temps utilisées, les cellules HEK293T dans une plaque à 96 puits ont été incubées avec la concentration recommandée par le fabricant d'alamarBlue pendant 3 h pour réduire le colorant. Le milieu de croissance contenant de l'alamarBlue réduit a été collecté, regroupé, centrifugé pour éliminer les cellules, puis incubé avec les concentrations de H2O2 utilisé dans l'expérience de viabilité (Fig. S2 supplémentaireB), et la fluorescence a été mesurée au cours du temps comme décrit précédemment. Nous avons observé

3% de perte de fluorescence après 4 h dans l'alamarBlue réduit traité avec 1250 M H2O2 la fluorescence des échantillons à toutes les autres concentrations n'était pas significativement différente du milieu équivalent contenant de l'alamarBlue réduit mais non traité avec H2O2. Ainsi, cette expérience de contrôle a confirmé que nos conditions expérimentales impliquant des oxydants sont compatibles avec les réactifs alamarBlue sensibles à l'oxydoréduction utilisés dans nos tests d'inhibition de la croissance.

Knockdown de HuR et Nrf2 avec un petit ARN interférent

De petits ARN interférents (si) ciblant le cadre de lecture ouvert de HuR ou Nrf2 humain ont été obtenus auprès de Dharmacon (tableau supplémentaire S6), et des siARN de contrôle non ciblés (contrôle siRNA-A ou -E) ont été obtenus auprès de Santa Cruz Biotechnology. HEK293T (3,6 X 10 5 cellules) dans des plaques 6 puits ont été transfectés avec des siRNA en utilisant Dharmafect I (Dharmacon) pendant 48 h en suivant le protocole du fabricant, puis dosés. Pour la cotransfection de l'ARNsi et du ou des plasmides pour les tests de rapporteur, les cellules ont été transfectées avec Dharmafect Duo (Dharmacon) pendant 48 h en suivant le protocole du fabricant, puis testées.

Western blot

Les cellules ont été remises en suspension dans du tampon RIPA (Santa Cruz Biotechnology) additionné d'inhibiteurs de protéase et de phosphatase et lysées par 3 cycles de congélation-dégel rapide. Les lysats ont été nettoyés par centrifugation (20 000 g, 10 min, 4°C) et la concentration totale en protéines a été déterminée par le test de Bradford. Typiquement, 20 à 40 ug de protéine totale ont été chargés par piste, séparés par SDS-PAGE, transférés sur PVDF, bloqués et incubés avec les anticorps appropriés (tableau supplémentaire S10). La détection a été effectuée sur un système d'imagerie ChemiDoc-MP (Bio-Rad) en utilisant le substrat de transfert Western ECL (Thermo Fisher Scientific) ou le substrat de sensibilité maximale SuperSignal West Femto (Thermo Fisher Scientific). Les données de transfert de Western ont été quantifiées à l'aide de l'outil d'analyse de gel dans ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, États-Unis). Les bandes d'intérêt ont été intégrées et normalisées au contrôle de chargement.

Dosages rapporteurs de luciférase

Des dosages de rapporteur de luciférase ont été effectués comme décrit précédemment (43). Brièvement, les cellules ont été cotransfectées avec le plasmide luciférase de luciole [pGL4.37 E364A pour les dosages de l'élément de réponse antioxydant:luciférase (Promega, Madison, WI, USA) pSGG contenant la séquence Nrf2 3'-UTR humaine (du Prof. Qun Zhou, University of Maryland Faculté de médecine)] et Renilla plasmide luciférase [pGL4.75, E693A (Promega)] dans un rapport 40:1 pendant 48 h en utilisant TransIT 2020 (Mirus Bio) ou Dharmafect Duo (Dharmacon). Pour les expériences impliquant l'expression de la protéine ectopique, le mélange de plasmide rapporteur 40:1 a été cotransfecté avec le plasmide d'expression de la protéine ectopique dans un rapport de 1:1. Les cellules ont été lysées pendant 15 min dans un tampon de lyse passive (Promega) avec une agitation douce, et le lysat homogénéisé a été transféré dans les puits d'une plaque blanche opaque à 96 puits (Corning, Corning, NY, USA). Luciole et Renilla l'activité luciférase a été mesurée sur un lecteur de microplaques BioTek Cytation3. Pour les dosages impliquant un traitement au HNE, le milieu a été remplacé par un milieu contenant la concentration indiquée de HNE 30 h après la transfection, et les cellules ont été incubées pendant 18 h supplémentaires.

PCR quantitative en temps réel

La PCR quantitative en temps réel (qPCR) a été réalisée comme décrit précédemment (44). L'ARN total a été isolé des cellules en utilisant le réactif Trizol (Thermo Fisher Scientific) en suivant le protocole du fabricant. Un microgramme d'ARN total (pureté/intégrité évaluée par électrophorèse sur gel d'agarose et concentration déterminée par A260 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques BioTek Cytation3 avec un accessoire Take3) a été traité avec de la DNase I de qualité amplification (Thermo Fisherr Scientific) et transcrit à l'envers à l'aide d'Oligo(dT)20 comme amorce et la transcriptase inverse Superscript III (Thermo Fisherr Scientific) en suivant le protocole du fabricant. La PCR a été réalisée pour 2 réplicats techniques par échantillon en utilisant iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) et des amorces spécifiques au gène d'intérêt (tableau supplémentaire S11) selon le protocole du fabricant. Les amplicons choisis avaient une longueur de 150 à 200 pb et n'avaient pas de liaison hors cible prédite par l'outil de recherche d'alignement local de base (BLAST National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, États-Unis). Pour les gènes avec de multiples variantes d'épissage, des amorces qui amplifiaient les séquences conservées dans toutes les variantes d'épissage ont été choisies. Les amorces ont été validées à l'aide de courbes standard générées par amplification d'amorces d'ADNc diluées en série avec une pente de courbe standard entre -0,8 et 1,2 et R2 0,97 ont été considérées comme efficaces. Les produits de PCR uniques ont été confirmés par analyse de fusion suivant le protocole PCR. Les données ont été recueillies à l'aide d'un LightCycler 480 (Roche). Les cycles seuils ont été déterminés à l'aide du logiciel LightCycler 480. Les échantillons avec un cycle de seuil >35 ou sans un seul point de fusion correct n'ont pas été inclus dans l'analyse des données. La normalisation a été effectuée en utilisant un seul gène de ménage comme indiqué dans chaque ensemble de données et leCt méthode.

Analyse des niveaux d'ARNm rapporteur

Des cellules HEK293T (1,6 X 105) dans des plaques à 12 puits ont été transfectées avec des rapporteurs luciférase comme décrit précédemment pendant 48 h.Les cellules ont ensuite été lysées dans 250 ul de tampon de lyse passive pendant 15 min sous agitation, et 50 ul de lysat ont été prélevés pour mesurer l'activité luciférase comme décrit ci-dessus. Du Trizol LS a été ajouté au lysat restant et l'ARN a été isolé comme décrit ci-dessus. Avant la RT, l'ARN total (1 mg) a été traité avec de la DNase I de qualité amplification (Thermo Fisher Scientific) pour éliminer tout plasmide résiduel. La RT et la qPCR en temps réel ont ensuite été réalisées comme ci-dessus.

Immunoprécipitation d'ARN-PCR

L'immunoprécipitation d'ARN (RIP)-PCR a été réalisée en suivant les méthodes décrites précédemment (45). Des cellules HEK293T (4,5 X 10 6 ) dans des plaques de 10 cm de diamètre ont été transfectées avec les constructions indiquées (mélangées 1:3 avec un plasmide vide) ou un plasmide vide seul (8 g d'ADN total par plaque) avec de la polyéthylèneimine (21 g/plaque) . Le milieu a été changé 24 h après la transfection et les cellules ont été incubées pendant 48 h au total. Les cellules ont été lavées une fois avec du PBS (Thermo Fisher Scientific), récoltées par trypsinisation et lavées soigneusement avec du PBS.

Les culots cellulaires ont été remis en suspension dans un tampon de lyse polysome [10 mM d'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (Chem-Impex International) pH 7,0, 100 mM de KCl (Thermo Fisher Scientific), 5 mM de MgCl2 (Thermo Fisher Scientific), 0,5 % de Nonidet-P40, cocktail complet d'inhibiteurs de protéase sans EDTA (Roche), 0,2 % de complexe de vanadyl ribonucéloside (New England Biolabs)] et congelé à -80 °C pendant au moins 30 min. Le lysat a été décongelé, centrifugé deux fois (20 000 g, 10 min chacun), et la concentration en protéines a été déterminée en utilisant le test Bradford. Trois milligrammes de protéines totales ont été dilués à 0,5 mg/ml dans du tampon NT2 [50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl (Thermo Fisher Scientific), 1 mM MgCl2 (Thermo Fisher Scientific), 0,05 % de Nonidet-P40, 0,2 % de complexe vanadyl ribonucéloside] et incubé avec 50 µl d'agarose Flag M2 (MilliporeSigma) pendant 3 h à 4°C avec rotation bout à bout. La résine a été lavée au moins 4 fois (5 min/lavage) avec du tampon NT2 contenant 300 mM de NaCl, et une partie de la résine a été conservée pour l'analyse Western blot. La résine a été remise en suspension dans 100 pi de NT2, additionnée de 0,1 % de SDS et de 3 mg/ml de protéinase K (Santa Cruz Biotechnology), et incubée à 55°C pendant 30 min. L'ARN a été isolé à l'aide du réactif Trizol en suivant le protocole du fabricant et analysé par qPCR en temps réel comme décrit précédemment.

Analyse de la stabilité de l'ARNm

Les cellules HEK293T shHuR/shAUF1 et shControl (9,6 X 105 cellules) dans des plaques à 6 puits ont été traitées avec 5 ug/ml d'actinomycine D (MilliporeSigma) et récoltées dans du Trizol comme décrit ci-dessus aux moments indiqués. Le niveau d'ARNm Nrf2 restant a été évalué par qPCR en temps réel comme décrit précédemment.

Fractionnement nucléaire-cytosolique pour l'isolement d'ARN

Cette procédure a été adaptée à partir d'un protocole rapporté (46). Des cellules HEK293T (9,6 x 105 cellules) dans des plaques à 6 puits ont été récoltées par tryspinisation et lavées deux fois avec du PBS froid. Les culots cellulaires ont ensuite été remis en suspension dans du tampon RSB [10 mM Tris (Chem-Impex International) pH 7,4, 10 mM NaCl (Thermo Fisher Scientific), 3 mM MgCl2 (Thermo Fisher Scientific)], incubé sur glace pendant 3 min, et centrifugé (1500 g, 3 minutes, 4°C). Les cellules ont été remises en suspension dans du tampon RSBG40 [10 mM Tris pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 10 % de glycérol (MilliporeSigma), 0,5 % de Nonidet P-40, 0,5 mM de DTT (VWR International, Radnor, PA, USA) et 100 U/ml de RNaseOUT (Thermo Fisher Scientific)] et lysé avec un léger pipetage de haut en bas. La suspension a été centrifugée (4500 g, 3 min, 4°C), et le surnageant a été conservé comme fraction cytosolique. La fraction nucléaire (pastille) a de nouveau été remise en suspension dans du RSBG40 et une solution détergente 10X [concentrations finales : 3,3 % de désoxycholate de sodium (Chem-Impex International), 6,6 % de Tween 20 (Thermo Fisher Scientific)] a été ajoutée. Les noyaux ont été pipetés de haut en bas plusieurs fois et la suspension a été incubée sur de la glace pendant 5 min puis centrifugée (4500 g, 3 minutes, 4°C). Le surnageant a été regroupé avec le surnageant précédent et l'échantillon combiné a été utilisé comme fraction cytosolique. Les noyaux ont été lavés une fois de plus avec du RSBG40, centrifugés (9500 g, 3 min, 4°C), et remis en suspension complètement dans RSBG40. Trizol LS a ensuite été ajouté à chaque échantillon et l'ARN a été isolé, traité avec de la DNase I de qualité amplification et soumis à une qPCR comme décrit ci-dessus.

Élevage, microinjection et imagerie du poisson zèbre

Toutes les procédures de poisson zèbre ont été effectuées conformément aux directives des National Institutes of Health des États-Unis et ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université Cornell (IACUC). Tg(-3.4gstp1:GFP)it416b les poissons ont été obtenus auprès du Riken Brain Science Institute (Wako, Japan National BioResource Project, Zebrafish). Des poissons transgéniques ont été croisés avec des poissons de type sauvage pour générer un mélange de descendance hétérozygote et de type sauvage pour des expériences. Des œufs fécondés au stade unicellulaire ont reçu une injection de 8 ng d'oligonucléotides morpholino (MO) ciblant zHuR (elavl1a) ou zAUF1 (hnrnpd) ou un MO de contrôle aléatoire (Gene Tools, Philomath, OR, USA Supplemental Table S7). Les poissons ont été criblés pour l'expression de la protéine de fluorescence verte (GFP) par imagerie avec un stéréoscope à fluorescence Leica M205-FA (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne)

24 h après la fécondation. Après l'imagerie, les poissons ont été euthanasiés, lavés deux fois dans du PBS avec 0,1 % de Tween-20 et transférés dans du formaldéhyde à 4 % pour une analyse d'immunofluorescence supplémentaire (voir ci-dessous). L'expression de la GFP a été détectée à l'aide d'une coloration d'anticorps fluorescent rouge en raison du signal de fond élevé dans le canal GFP (ex : 488 nm em : 520-550 nm) à ce stade de développement du poisson zèbre, ce qui empêche une quantification précise.

Immunofluorescence en monture entière

L'immunocoloration de l'ensemble des larves de poisson zèbre a été réalisée comme décrit précédemment (47). Toutes les étapes d'incubation ont été réalisées avec un léger basculement. Les poissons euthanasiés ont été lavés deux fois avec du PBST (PBS + 0,1 % de Tween-20) et fixés dans du formaldéhyde à 4 % dans du PBS à 4°C pendant la nuit ou jusqu'à 7 jours. Les poissons ont ensuite été lavés deux fois pendant 30 min avec du PDT (PBST, 0,3 % Triton X-100, 1 % DMSO), bloqués pendant 1 h à température ambiante dans un tampon de blocage (PBST, 10 % FBS, 2 % BSA) et incubés avec anticorps primaire (tableau supplémentaire S10) dans du tampon de blocage pendant 2 h à température ambiante ou pendant une nuit à 4°C. Les poissons ont été lavés deux fois avec du PDT, rebloqués pendant 1 h à température ambiante et incubés avec un anticorps secondaire (tableau supplémentaire S10) dans un tampon de blocage pendant 1,5 h à température ambiante. Après l'incubation des anticorps secondaires, les poissons ont été lavés deux fois avec de la PDT, puis imagés. La fluorescence a été quantifiée à l'aide de l'outil « Measure » ​​dans ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, États-Unis).

Expression et purification de son6-HuR

Des cellules BL21-CodonPlus (Agilent Technologies) ont été transformées avec le plasmide pET28a codant pour His6-TEV-HuR. Une seule colonie a été divisée en plusieurs cultures starter (5 ml) et cultivée dans un milieu de bouillon de lysogénie contenant du chloramphénicol et de la kanamycine pendant une nuit à 37°C sous agitation. Les cultures ont ensuite été chacune diluées dans 1 L de bouillon de lysogénie contenant de la kanamycine et cultivées à 37°C sous agitation jusqu'à densité optique (DO)600 nm = 0,5, auquel point de l'isopropyl-β-D-thiogalactoside (concentration finale 1 mM GoldBio, St. Louis, MO, USA) a été ajouté pour induire l'expression. La température a ensuite été réduite à 18°C ​​et les cultures ont été cultivées pendant une nuit sous agitation. D'autres étapes ont été réalisées à 4°C. Les cellules ont été récoltées par centrifugation (4000 g, 20 min, 4°C), remis en suspension dans du tampon de lyse [20 mM Tris pH 7,5, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM d'imidazole (Thermo Fisher Scientific), 5% de glycérol, 5 mM de β-mercaptoéthanol (βME) et 0,5 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA)] et lysé par 2 passages à travers un perturbateur cellulaire Emlusiflex (Avestin Europe, Mannheim, Allemagne). Les débris ont été éliminés par centrifugation (20 000 g, 30 min, 4°C). Du sulfate de streptomycine (1 % en poids/volume) a été ajouté goutte à goutte sur 20 min sous agitation douce, et le matériau précipité a été clarifié par centrifugation (20 000 g, 30 min, 4°C). Le lysat a ensuite été incubé avec de la résine de nickel (Qiagen) pendant 1 h sous agitation douce. La résine a été lavée progressivement avec des tampons de lavage (20 mM Tris pH7,5 150 mM KCl 2 mM MgCl2 50, 100, 200 mM d'imidazole et 5 mM de ME). La protéine a été éluée avec un tampon d'élution [20 mM Tris pH 7,5, 150 mM KCl, 2 mM MgCl2, 300 mM d'imidazole (Thermo Fisher Scientific), 5 mM ME], concentré et chargé sur une colonne de chromatographie d'exclusion stérique (système de purification ÄKTA, Hiload 26/600 Superdex 75 prep grade GE Healthcare, Chicago, IL, USA) et exécuté dans un tampon de stockage (20 mM Tris pH 7,5, 200 mM KCl, 2 mM MgCl2, 5% glycérol, 5 mM TCEP). La protéine a été collectée, concentrée, divisée en aliquotes, congelée rapidement dans de l'azote liquide et stockée à -80°C dans des aliquotes à usage unique pour éviter le gel/dégel.

Expression et purification de son6-AUF1

Des cellules BL21-CodonPlus (Agilent Technologies) ont été transformées avec pET28a His6-AUF1 (p37) et cultivé comme décrit ci-dessus. La procédure de purification était la même que pour Son6HuR sauf pour les tampons : tampon de lyse [50 mM NaH2Bon de commande4 pH 7,6, 300 mM de NaCl, 5 mM d'imidazole, 5 mM de βME et 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle, 0,5 % de Nonidet P40, 0,15 mg/ml de lysozyme, 0,1 mg/ml de RNase A (MilliporeSigma)] tampons de lavage (50 mM de NaH2Bon de commande4 pH 7,6 150 mM NaCl 20, 50, 100, mM imidazole et 5 mM ME) tampon d'élution (50 mM NaH2Bon de commande4 pH 7,6, 150 mM de NaCl, 250 mM d'imidazole, 5 mM de ME). L'éluat a été additionné de 0,1 mg/ml de RNase A et tourné bout à bout pendant 1 h à température ambiante. Le mélange résultant a ensuite été dialysé contre un tampon de stockage [50 mM d'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique pH 7,6, 150 mM de KCl, 2 mM de MgCl2, 2 mM TCEP] pendant 2 h à 4°C, puis le tampon de dialyse a été changé et la dialyse a été laissée se dérouler pendant une nuit à 4°C. La protéine a ensuite été concentrée et stockée (avec 5% de glycérol ajouté au tampon de stockage) à -80°C dans des aliquotes à usage unique pour éviter le gel/dégel.

[32 P]-Marquage de fin d'oligos d'ARN

Les oligos d'ARN (IDT, Coralville, IA, USA Tableau supplémentaire S8) ont été remis en suspension dans de l'eau sans RNase à 200 uM. L'ARN a été marqué avec de l'-[ 32 P] ATP (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) dans une réaction contenant (concentrations finales) 20 pmol d'ARN, 20 pmol d'γ-[ 32 P] ATP, un tampon polynucléotide kinase 1X (New England Biolabs ), et 0,4 U/μl de polynucléotide kinase (New England Biolabs) dans un volume total de 50 l. La réaction a été incubée à 37°C pendant 1 h, après quoi 50 pi d'eau sans RNase et 300 pi de Trizol LS ont été ajoutés, et le mélange a été laissé à température ambiante pendant 5 min. CHCl3 (200 l) a été ajouté, le mélange a été agité pendant 15 s, laissé à température ambiante pendant 2 min, puis centrifugé brièvement pour recueillir le contenu. La couche aqueuse a été recueillie et mélangée avec un volume égal de CHCl3, secoué et filé brièvement. La couche aqueuse a de nouveau été collectée, additionnée de 15 ug de GlycoBlue (Ambion) et d'acétate d'ammonium à une concentration finale de 500 mM, et 3 volumes d'EtOH à 100 % ont été ajoutés. Le mélange a été vortexé et laissé précipiter pendant une nuit à -20°C, puis centrifugé (20 000 g, 15 minutes, 4°C). Le culot d'ARN marqué a été lavé deux fois avec 75 % d'EtOH dans de l'eau sans RNase, séché brièvement et remis en suspension dans de l'eau sans RNase. L'ARN marqué a été stocké à -80°C dans des aliquotes à usage unique pour éviter le gel/dégel.


Les RBP exercent une régulation par rétroaction à différents niveaux post-transcriptionnels

Les RBP peuvent contrôler l'expression des gènes à différentes étapes de la synthèse de l'ARN à sa désintégration. Souvent, le mécanisme par lequel les RBP contrôlent leurs propres niveaux est le même par lequel ils régulent leurs ARN cibles. Par exemple, des facteurs d'épissage tels que les protéines SR ou les RNP nucléaires hétérogènes (hnRNP) médient l'épissage alternatif (AS) improductif de leurs ARNm lors de la surexpression. Cela génère des transcrits qui contiennent des codons de terminaison prématurée (PTC), qui déclenchent une dégradation rapide de l'ARN ( Wollerton et al., 2004 Lareau et al., 2007 Ni et al., 2007). D'autres facteurs d'épissage, tels que les protéines de Fox, utilisent l'AS pour produire des isoformes négatives dominantes qui entrent en compétition avec les protéines de pleine longueur (Daminov et Black, 2010). Les régulateurs traductionnels, tels que SRSF1, inhibent plutôt la traduction de leurs propres ARNm (Sun et al., 2010), tandis que le facteur d'exportation NXF1 se lie et favorise l'exportation de son propre transcrit qui contient un intron retenu, ce qui conduit soit à un dégradation de cet ARN ou à la synthèse d'une isoforme tronquée et inactive de la protéine NXF1 ( Li et al., 2006).

Dans certains cas, les RBP exercent une rétroaction homéotique à plusieurs niveaux. La protéine ribosomique L32 de levure, par exemple, peut contrôler à la fois l'épissage et la traduction de son propre ARNm, en adaptant sa production au taux de synthèse des précurseurs du ribosome (Dabeva et Warner, 1993). Les Drosophile protéine Sex-lethal (Sxl) utilise même des mécanismes de rétroaction positive et négative qui opèrent au niveau de l'épissage et de la traduction. Cela se traduit par une expression génique de type commutateur binaire (médiée par une rétroaction positive), tout en empêchant simultanément la surproduction délétère de la protéine par rétroaction négative ( Moschall et al., 2017).


Combien de protéines de liaison à l'ARN peuvent se lier simultanément à un seul ARNm ? - La biologie

Les gouttelettes de protéines sédimentent sans support matriciel. Le marquage de spin à des positions spécifiques des expériences FUS et EPR a révélé que la protéine est encore compactée à l'intérieur des gouttelettes tandis que la RMN de diffusion a quantifié les proportions de FUS dans les différentes phases.

Un article récent de "Nature Chemical Biology" par le groupe Allain (IMBB) en collaboration avec les laboratoires Jeschke (DCHAB-PC) et Klotzsch (HEST & Humboldt) démontre une nouvelle méthode pour simultanément quantifier FUS dans les gouttelettes et caractériser structurellement FUS à la fois dans le et phases condensées.

De nombreuses protéines de liaison à l'ARN subissent une séparation de phase liquide-liquide, ce qui sous-tend la formation d'organites sans membrane, tels que les granules de stress et les corps P. Les études du mécanisme moléculaire de la séparation de phases in vitro sont entravées par la coalescence et la sédimentation de gouttelettes de la taille d'organites qui interagissent avec les surfaces de verre. Ici, nous démontrons que les gouttelettes liquides de FUS, qui est une protéine présente dans les agrégats cytoplasmiques des patients SLA et FTD, peuvent être stabilisées in vitro à l'aide d'un hydrogel d'agarose qui agit comme un imitateur du cytosquelette. Cela permet leur caractérisation spectroscopique par RMN en phase liquide et spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE). Les signaux protéiques des phases dispersées et condensées peuvent être observés simultanément et leurs proportions respectives être quantifiées avec précision. De plus, l'hydrogel d'agarose agit comme un cryoprotecteur pendant la congélation de choc, ce qui facilite les mesures de RPE pulsée à des températures cryogéniques. Étonnamment, les mesures de résonance double électron-électron (DEER) ont révélé un compactage de FUS dans la phase condensée.

Figure et texte aimablement fournis par les auteurs.
Les deux ont été publiés ainsi que News sur le site Web de l'ETH D-BIOL.


Biologie Chapitre 17 Quiz

C) Différents organismes ont différents types d'acides aminés.

B) l'épissage post-transcriptionnel

C) traduction en l'absence de ribosome

B) Il modifie un acide aminé dans la protéine codée.

C) Il modifie le cadre de lecture de l'ARNm.

B) L'ARN de transfert transmet les informations de l'ADN directement à un ribosome, où a lieu la synthèse des protéines.

C) L'ARN messager est transcrit à partir d'un seul gène et transfère les informations de l'ADN du noyau vers le cytoplasme, où a lieu la synthèse des protéines.

B) La traduction des codons est médiée par les ARNt chez les eucaryotes, mais la traduction ne nécessite aucune molécule intermédiaire telle que les ARNt chez les procaryotes.

C) Les codons procaryotes contiennent généralement des bases différentes de celles des eucaryotes.

B) Les nucléotides en excès (ACCA) seront clivés au niveau du ribosome.

C) Le capuchon 5' de l'ARNm deviendra lié de manière covalente.

B) C'est un mécanisme pour augmenter le taux de traduction.

C) Il augmente le taux de transcription.

B) codon qui spécifie le même acide aminé que le codon d'origine

C) une substitution d'acide aminé qui modifie la structure tertiaire de la protéine

B) Le code génétique est universel (le même pour tous les organismes).

C) Le code génétique est différent pour différents domaines d'organismes.

B) Les cellules procaryotes ont des mécanismes compliqués pour cibler les protéines vers les organites cellulaires appropriés.

C) Un traitement approfondi de l'ARN est nécessaire avant que les transcrits procaryotes puissent être traduits.

B) les protéines sont synthétisées

B) lecture du prochain codon de l'ARNm

B) Les gènes dictent la production d'enzymes spécifiques, et les individus affectés ont des défauts génétiques qui leur font manquer certaines enzymes.

C) Les enzymes sont constituées d'ADN et les individus affectés manquent d'ADN polymérase.

B) Il fournit une source d'énergie pour terminer la traduction.

C) Il libère le ribosome du RE pour permettre aux polypeptides d'entrer dans le cytosol.

B) la liaison de l'anticodon au codon et la fixation des acides aminés aux ARNt

C) liaison des ribosomes à l'ARNm

B) un polypeptide manquant d'un acide aminé

B) le ribosome atteint un codon stop

C) appariement de bases de méthionine-ARNt activé à AUG de l'ARN messager

B) L'ARN polymérase se transcrit via le signal de polyadénylation, provoquant l'association des protéines avec le transcrit et le séparant de la polymérase.

C) L'ARN polymérase transcrit via la séquence de terminaison, provoquant la séparation de la polymérase de l'ADN et la libération du transcrit.


83 Régulation des gènes post-transcriptionnels eucaryotes

À la fin de cette section, vous serez en mesure d'effectuer les opérations suivantes :

  • Comprendre l'épissage de l'ARN et expliquer son rôle dans la régulation de l'expression des gènes
  • Décrire l'importance de la stabilité de l'ARN dans la régulation des gènes

L'ARN est transcrit, mais doit être transformé en une forme mature avant que la traduction puisse commencer. Ce traitement qui a lieu après qu'une molécule d'ARN a été transcrite, mais avant qu'elle ne soit traduite en une protéine, est appelé modification post-transcriptionnelle. Comme pour les étapes épigénétiques et transcriptionnelles du traitement, cette étape post-transcriptionnelle peut également être régulée pour contrôler l'expression des gènes dans la cellule. Si l'ARN n'est pas traité, transporté ou traduit, aucune protéine ne sera synthétisée.

L'épissage de l'ARN, la première étape du contrôle post-transcriptionnel

Dans les cellules eucaryotes, le transcrit d'ARN contient souvent des régions, appelées introns, qui sont éliminées avant la traduction. Les régions de l'ARN qui codent pour les protéines sont appelées exons. ((Chiffre)). Après la transcription d'une molécule d'ARN, mais avant son départ du noyau à traduire, l'ARN est traité et les introns sont éliminés par épissage. L'épissage est effectué par des spliceosomes, des complexes ribonucléoprotéiques capables de reconnaître les deux extrémités de l'intron, de couper le transcrit à ces deux points et de rassembler les exons pour la ligature.


Épissage alternatif de l'ARN Dans les années 1970, on a observé pour la première fois des gènes qui présentaient un épissage alternatif de l'ARN. L'épissage alternatif de l'ARN est un mécanisme qui permet à différents produits protéiques d'être produits à partir d'un gène lorsque différentes combinaisons d'exons sont combinées pour former l'ARNm ((Figure)). Cet épissage alternatif peut être aléatoire, mais le plus souvent il est contrôlé et agit comme un mécanisme de régulation des gènes, avec la fréquence des différentes alternatives d'épissage contrôlées par la cellule comme moyen de contrôler la production de différents produits protéiques dans différentes cellules ou à différents stades de développement. L'épissage alternatif est maintenant compris comme un mécanisme commun de régulation des gènes chez les eucaryotes, selon une estimation, 70 pour cent des gènes chez l'homme sont exprimés sous forme de protéines multiples grâce à l'épissage alternatif. Bien qu'il existe plusieurs façons d'épisser alternativement les transcrits d'ARN, l'ordre original 5′-3′ des exons est toujours conservé. C'est-à-dire qu'un transcrit avec les exons 1 2 3 4 5 6 7 peut être épissé 1 2 4 5 6 7 ou 1 2 3 6 7, mais jamais 1 2 5 4 3 6 7.


Comment l'épissage alternatif pourrait-il évoluer ? Les introns ont une séquence de reconnaissance de début et de fin, il est facile d'imaginer l'échec du mécanisme d'épissage à identifier la fin d'un intron et à trouver la fin de l'intron suivant, supprimant ainsi deux introns et l'exon intermédiaire. En fait, il existe des mécanismes pour empêcher un tel saut d'intron, mais les mutations sont susceptibles de conduire à leur échec. De telles « erreurs » produiraient plus que probablement une protéine non fonctionnelle. En effet, la cause de nombreuses maladies génétiques est un épissage anormal plutôt que des mutations dans une séquence codante. Cependant, l'épissage alternatif pourrait éventuellement créer une variante de protéine sans perte de la protéine d'origine, ouvrant des possibilités d'adaptation de la nouvelle variante à de nouvelles fonctions. La duplication de gènes a joué un rôle important dans l'évolution de nouvelles fonctions d'une manière similaire en fournissant des gènes qui peuvent évoluer sans éliminer la protéine fonctionnelle d'origine.

Question : Dans le serpent des blés Pantherophis guttatus, il existe plusieurs variantes de couleurs différentes, y compris les serpents amélaniques dont les motifs de peau n'affichent que des pigments rouges et jaunes. La cause de l'amélanisme chez ces serpents a été récemment identifiée comme l'insertion d'un élément transposable dans un intron du gène OCA2 (albinisme oculocutané). Comment l'insertion de matériel génétique supplémentaire dans un intron pourrait-elle conduire à une protéine non fonctionnelle ?

Visualisez comment l'épissage de l'ARNm se produit en regardant le processus en action dans cette vidéo.

Contrôle de la stabilité de l'ARN

Avant que l'ARNm ne quitte le noyau, il reçoit deux "capsules" protectrices qui empêchent les extrémités du brin de se dégrader au cours de son voyage. Les exonucléases 5′ et 3′ peuvent dégrader les ARN non protégés. Le capuchon 5′, qui est placé à l'extrémité 5′ de l'ARNm, est généralement composé d'une molécule de guanosine triphosphate méthylée (GTP). Le GTP est placé à l'envers à l'extrémité 5 de l'ARNm, de sorte que les 5 atomes de carbone du GTP et le nucléotide terminal sont liés par trois phosphates. La queue poly-A, qui est attachée à l'extrémité 3 & 8242, est généralement composée d'une longue chaîne de nucléotides d'adénine. Ces changements protègent les deux extrémités de l'ARN de l'attaque des exonucléases.

Une fois que l'ARN est transporté vers le cytoplasme, la durée pendant laquelle l'ARN y réside peut être contrôlée. Chaque molécule d'ARN a une durée de vie définie et se désintègre à une vitesse spécifique. Ce taux de décomposition peut influencer la quantité de protéines dans la cellule. Si le taux de décroissance augmente, l'ARN n'existera pas dans le cytoplasme aussi longtemps, ce qui raccourcira le temps disponible pour que la traduction de l'ARNm se produise. Inversement, si le taux de dégradation est diminué, la molécule d'ARNm résidera plus longtemps dans le cytoplasme et plus de protéines pourront être traduites. Ce taux de dégradation est appelé stabilité de l'ARN. Si l'ARN est stable, il sera détecté plus longtemps dans le cytoplasme.

La liaison des protéines à l'ARN peut également influencer sa stabilité. Les protéines appelées protéines de liaison à l'ARN, ou RBP, peuvent se lier aux régions de l'ARNm juste en amont ou en aval de la région codant pour la protéine. Ces régions de l'ARN qui ne sont pas traduites en protéines sont appelées régions non traduites ou UTR. Ce ne sont pas des introns (ceux-ci ont été supprimés dans le noyau). Ce sont plutôt des régions qui régulent la localisation, la stabilité et la traduction des protéines de l'ARNm. La région juste avant la région codant pour la protéine est appelée 5 & 8242 UTR , tandis que la région après la région codante est appelée 3 & 8242 UTR ((Figure)). La liaison des RBP à ces régions peut augmenter ou diminuer la stabilité d'une molécule d'ARN, en fonction de la RBP spécifique qui se lie.


Stabilité de l'ARN et microARN

En plus des RBP qui se lient à et contrôlent (augmentent ou diminuent) la stabilité de l'ARN, d'autres éléments appelés microARN peuvent se lier à la molécule d'ARN. Ces microARN, ou miARN, sont de courtes molécules d'ARN qui ne mesurent que 21 à 24 nucléotides. Les miARN sont fabriqués dans le noyau sous forme de pré-miARN plus longs. Ces pré-miARN sont découpés en miARN matures par une protéine appelée Dés . Comme les facteurs de transcription et les RBP, les miARN matures reconnaissent une séquence spécifique et se lient à l'ARN. Cependant, les miARN s'associent également à un complexe ribonucléoprotéique appelé complexe de silençage induit par l'ARN (RISC). Le composant ARN des paires de bases RISC avec des séquences complémentaires sur un ARNm et empêche la traduction du message ou conduit à la dégradation de l'ARNm.

Résumé de la section

Le contrôle post-transcriptionnel peut se produire à n'importe quel stade après la transcription, y compris l'épissage de l'ARN et la stabilité de l'ARN. Une fois l'ARN transcrit, il doit être traité pour créer un ARN mature prêt à être traduit. Cela implique l'élimination des introns qui ne codent pas pour les protéines. Les spliceosomes se lient aux signaux qui marquent la frontière exon/intron pour éliminer les introns et ligaturer les exons ensemble. Une fois que cela se produit, l'ARN est mature et peut être traduit. L'épissage alternatif peut produire plus d'un ARNm à partir d'un transcrit donné. Différentes variantes d'épissage peuvent être produites dans différentes conditions.

L'ARN est créé et épissé dans le noyau, mais doit être transporté vers le cytoplasme pour être traduit. L'ARN est transporté vers le cytoplasme à travers le complexe de pores nucléaires. Une fois que l'ARN est dans le cytoplasme, la durée pendant laquelle il y réside avant d'être dégradé, appelée stabilité de l'ARN, peut également être modifiée pour contrôler la quantité globale de protéine synthétisée. La stabilité de l'ARN peut être augmentée, conduisant à un temps de résidence plus long dans le cytoplasme, ou diminuée, conduisant à un temps plus court et à une synthèse protéique moindre. La stabilité de l'ARN est contrôlée par les protéines de liaison à l'ARN (RPB) et les microARN (miARN). Ces RPB et miARN se lient au 5 & 8242 UTR ou au 3 & 8242 UTR de l'ARN pour augmenter ou diminuer la stabilité de l'ARN. Les microARN associés aux complexes RISC peuvent réprimer la traduction ou conduire à la dégradation de l'ARNm.


Sommaire

La connaissance du rôle des réseaux d'ARN associés aux modifications de l'ARN et aux interactions ARN-RBP dans la régulation inflammatoire et métabolique de l'obésité est limitée. Cependant, l'accumulation de preuves a mis en lumière la façon dont les réseaux d'ARN affectent dynamiquement les mécanismes métaboliques, développementaux et inflammatoires dans la pathogenèse des troubles associés à l'obésité. En effet, les changements fonctionnels de RBP supplémentaires, y compris mais sans s'y limiter LIN28A, IGF2BP2/IMP2 et HuR, sont liés au développement de maladies métaboliques (213�). La méthylation de l'ARN influence et trace le destin de l'ARN vers la traduction, la dégradation ou même la séquestration à l'intérieur des compartiments cellulaires. Par conséquent, la modification réversible de l'ARN, en particulier la méthylation de l'ARN, représente un nouveau marqueur épigénétique, similaire aux modifications réversibles de l'ADN, qui fournit des indices sur les réponses cellulaires adaptatives associées aux changements métaboliques en réponse à des stimuli de stress exogènes ou endogènes distincts, notamment des nutriments excessifs, des toxines et microbiens. infections (216, 217). Les modifications de l'ARN pourraient affecter les réseaux ARN-RBP et les événements biologiques émergents, notamment l'exportation et le transport de l'ARN, le clivage, la maturation et la stabilité de l'ARN, ainsi que les modifications fonctionnelles des RBP (218). Le dévoilement de ces rôles régulateurs épigénétiques des réseaux d'ARN est important pour clarifier la pathogenèse des maladies chroniques, y compris, mais sans s'y limiter, l'obésité, les maladies cardiovasculaires, le vieillissement et les maladies auto-immunes, où les mécanismes moléculaires exacts sont encore mal définis.

Alors que les modifications de l'ARN sont généralement considérées comme un processus de réglage fin de l'homéostasie cellulaire, des signaux externes prolongés, y compris l'alimentation chronique par HFD, peuvent progressivement accumuler des modifications erronées de l'ARN qui conduisent le destin cellulaire vers des états inflammatoires chroniques et de bas grade qui sont bien observés au niveau cellulaire. caractéristiques de l'obésité. Ce concept est étayé par des preuves que plusieurs RBP inflammatoires, dont TLR3, TLR7 et PKR, sont impliquées dans l'induction de l'inflammation chronique associée à l'obésité. Comme la modification de la méthylation de l'ARNm pourrait influencer le silençage génique post-transcriptionnel et contrôler l'expression génique ciblée, par exemple en affectant les interactions avec le complexe de protéines ARNm/miARN/Ago, il peut y avoir des types et des modifications spécifiques d'ARN qui activent des programmes métaboliques et inflammatoires dans la pathogenèse de obésité.

Les progrès techniques actuels nous ont permis d'étudier les changements quantitatifs dans de nombreux types d'espèces d'ARN, soit les niveaux d'ARN codants ou non codants, et l'état de méthylation (219�). Cependant, le défi consiste à analyser avec précision le type de modification, le degré de modifications et à prédire leur signification biologique, en particulier l'effet de ces changements sur la structure secondaire de l'ARN, la localisation et les interactions avec des RBP spécifiques. Ces informations importantes conduiraient ensuite au développement de nouvelles thérapies pour modifier les interactions ARN-RBP dans l'obésité et le DT2. Néanmoins, pour étudier les composants qui gèrent la spécificité de l'ARN, les mécanismes de régulation et les fonctions des RBP, il est important de prioriser les méthodes qui caractérisent les interactions protéine-ARN endogènes directes. Au cours de la dernière décennie, plusieurs méthodes RIP, y compris la réticulation et l'immunoprécipitation (CLIP) et la méthylation individu-nucléotide-résolution CLIP (miCLIP), ont été développées pour déterminer la in vivo Cibles d'ARN des RBP (221�). L'utilisation de RBP connues pour être impliquées dans les maladies inflammatoires et métaboliques pour identifier les ARN « pathologiques » par RIP fournirait des approches uniques pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires des maladies inflammatoires chroniques. De tels efforts pourraient ouvrir la voie à de nouvelles cibles thérapeutiques et pharmacologiques et/ou à des interventions pour lutter contre les séquelles induites par l'obésité.


Résultats

RBPs différentiellement exprimés dans STAD

La conception de l'étude est illustrée à la figure 1. Il a été révélé par l'analyse GEPIA que les DEG dans STAD comprenaient 896 gènes régulés à la baisse et 3475 gènes régulés à la hausse (figure 2A). Parmi les 1542 RBP, 362 étaient exprimés de manière différentielle avec 331 régulés à la hausse et 31 régulés à la baisse (Figure 2B, Tableau S1).

Figure 1 Cadre d'analyse des RBP dans STAD.

Figure 2 Tracé de volcan des DEG connexes dans STAD. (UNE) Tracé de volcan de tous les DEG de STAD. (B) Graphique de volcan de RBP différentiellement exprimés dans STAD.

Analyse d'enrichissement des voies GO et KEGG des RBP différentiellement exprimées

Pour explorer les fonctions et les mécanismes de ces RBP différentiellement exprimés, nous avons effectué l'analyse fonctionnelle pour les RBP régulées à la baisse et à la hausse via WebGestalt.

Comme le montre le tableau 1, des différences significatives ont été observées dans l'enrichissement fonctionnel des RBP régulées à la baisse et à la hausse. En ce qui concerne la localisation au sein de la cellule, les RBP régulées à la baisse ont été enrichies en complexe spliceosomal de type U2, complexe snRNP spliceosomal, prespliceosome de type U2, prespliceosome et U1 snRNP, et RBP régulées à la hausse en U1 snRNP, U4 snRNP, U12-type box spliceosomal complexe, /Complexe ACA snoRNP et complexe de traitement des histones pré-ARNm 3⮞nd. Les différences de localisation au sein de la cellule signifiaient une fonction moléculaire différente, ce qui a été confirmé par l'analyse fonctionnelle moléculaire. L'analyse fonctionnelle moléculaire a démontré que les RBP régulées à la baisse participaient à la liaison à l'ARN, à la liaison à l'ARNm et à l'ARNsn et que les RBP régulées à la hausse dans la liaison de la coiffe de l'ARN 7-méthylguanosine, l'activité exoribonucléase, le facteur de croissance transformant-récepteur bêta, la liaison snoRNA box H/ACA et la liaison snRNP (tableau 1 ). L'analyse des processus biologiques a montré que les RBP régulées à la baisse étaient liées à une régulation positive du traitement de l'ARNm, à la sélection du site d'épissage de l'ARNm, à la régulation positive de l'épissage de l'ARN, à la régulation positive de l'épissage de l'ARNm et à la régulation de l'autophagie médiée par les chaperons tandis que les RBP surexprimaient l'exportation de la sous-unité ribosomique du noyau, terminaison de la transcription de l'ARN polymérase II, régulation positive de l'assemblage du corps de traitement de l'ARNm cytoplasmique, régulation de l'activité de la ribonucléase et clivage de l'ARNm impliqué dans l'extinction du gène (tableau 1).

Tableau 1 Enrichissement GO et analyse de la voie KEGG de RBP différemment exprimés

De plus, les RBP régulées à la baisse n'étaient enrichies que dans la voie du spliceosome, tandis que les RBPs régulées à la hausse de manière significative dans la biosynthèse de l'aminoacyl-ARNt, la biogenèse des ribosomes chez les eucaryotes, le transport de l'ARN, la voie de surveillance de l'ARNm, la dégradation de l'ARN et le spliceosome (tableau 1).

RBP de hub liées au pronostic

Pour analyser plus en détail les effets des RBP sur le pronostic des patients STAD, nous avons évalué la relation entre les RBP différentiellement exprimées et la SG via l'analyse de régression de Cox univariée et la méthode Kaplan–Meier dans la cohorte d'entraînement TCGA, dont les résultats suggèrent que 25 candidats Les RBP du hub étaient significativement associées à la SG (tableau 2). Par la suite, les impacts de ces 25 RBPs hub candidats sur la SG ont été évalués par une analyse multivariée, dont les résultats ont démontré que sept RBPs hubs étaient des prédicteurs pronostiques indépendants pour les patients STAD (Tableau 2).

Tableau 2 Analyse de régression de Cox pour l'identification des RBP Hub dans l'ensemble de données de formation

Construction du modèle pronostique

Un modèle prédictif basé sur les sept RBP de hub susmentionnés a ensuite été établi. Selon la formule : RS= (0.040* Exp PTBP1) + (𢄠.052* Exp PPIH) + (0,172* Exp SMAD5) + (𢄠.208* Exp MSI2) + (𢄠.474* Exp RBM15) + (0,072* Exp MRPS17) + (𢄠.248* Exp ADAT3), RS de chaque patient a été évalué. La capacité prédictive de RS a été évalué par une analyse de survie. Selon le RS médian, les 187 patients de la cohorte d'entraînement TCGA ont été répartis dans un groupe à faible risque et un groupe à haut risque. Les résultats de l'analyse de survie ont démontré que par rapport aux patients du groupe à faible risque, ceux du groupe à haut risque avaient une SG significativement plus faible (pπ.001, figure 3A). Afin d'évaluer davantage la capacité pronostique des sept RBP hub identifiés, nous avons ensuite effectué une analyse ROC en fonction du temps, dont les résultats ont démontré que l'aire sous la courbe ROC (AUC) de ces RBP RS modèle était de 0,804 (Figure 3B), indiquant la performance diagnostique modérée de ce modèle. Le statut de survie des patients, RS et la carte thermique d'expression de la signature composée de sept RBP hub dans les sous-groupes à faible et à haut risque sont affichées sur la figure 3C𠄾.

figure 3 Analyse du score de risque du modèle pronostique à sept gènes dans la cohorte d'entraînement TCGA. (UNE) Courbe de survie pour les sous-groupes à faible et à haut risque. (B) Courbes ROC pour la prévision de la SG en fonction du score de risque. (C) Statut de survie. () Score de risque. (E) Carte thermique d'expression.

Validation du modèle pronostique

Pour vérifier davantage la validité du modèle prédictif basé sur les sept RBP, nous avons analysé la cohorte de test TCGA comprenant 184 patients STAD et la cohorte GEO (GSE84437) comprenait 433 patients STAD, dont les résultats ont montré que par rapport aux patients présentant un score à faible risque, ceux avec un score de risque élevé avaient une SG significativement pire (pπ.05, Figure 4A pπ.05, Figure S1A). L'ASC de la cohorte de test TCGA et de la cohorte GEO était de 0,644 (figure 4B) et de 0,581 (Figure S1B), ce qui suggère une bonne sensibilité et spécificité du modèle prédictif. Le statut de survie des patients, RS et la carte thermique d'expression de sept RBP hub dans les cohortes de test TCGA et la cohorte GEO sont illustrées à la figure 4C𠄾 et Figure S1C𠄾. De plus, la signification pronostique de différentes variables a été évaluée chez les patients de la cohorte d'entraînement TCGA, de la cohorte de test TCGA et de la cohorte GEO par une analyse de régression de Cox, dont les résultats ont démontré que pour trois cohortes, RS étaient des facteurs pronostiques indépendants de la SG (pπ.01, Figure 5A pπ.05, Figure 5B pπ.01, Figure S1F). Les valeurs pronostiques des sept RBP du hub ont également été étudiées plus en détail par l'outil en ligne du traceur Kaplan-Meier, dont les résultats ont révélé que les sept RBP du hub étaient non seulement significativement associées à la SG mais aussi à la survie sans rechute (RFS) (Figure S2). En résumé, tous les résultats susmentionnés suggèrent que le modèle pronostique basé sur les sept RBPs était fiable pour prédire les résultats des patients STAD.

Figure 4 Analyse du score de risque du modèle pronostique à sept gènes dans la cohorte de test TCGA. (UNE) Courbe de survie pour les sous-groupes à faible et à haut risque. (B) Courbes ROC pour la prévision de la SG en fonction du score de risque. (C) Statut de survie. () Score de risque. (E) Carte thermique d'expression.

Figure 5 La valeur pronostique de différents paramètres cliniques. (UNE, B) Analyse de régression COX univariée et multivariée de différents paramètres cliniques dans la formation TCGA et la cohorte de test TCGA.

Construire un nomogramme prédictif

Un nomogramme a été construit pour générer un modèle cliniquement pratique qui permettrait aux médecins d'évaluer le pronostic des patients STAD à l'aide des sept RBP pivots (Figure 6). Sur la base des résultats de l'analyse de Cox multivariée, les points correspondants ont été attribués à chaque variable individuelle selon l'échelle de points dans le nomogramme. Une ligne horizontale a été tracée pour déterminer le point de chaque variable. Le point total pour chaque patient a été calculé en additionnant les points de toutes les variables, sur la base desquelles nous avons estimé le taux de survie de chaque patient à 1 an, 2 ans et 3 ans.

Figure 6 Nomogramme pour prédire la SG à 1, 2 et 3 ans des patients STAD dans la cohorte d'entraînement TCGA.

Réseau de biologie et fonctions des sept RBP hub

Pour étudier plus avant les fonctions des sept RBP hub dans STAD, nous avons créé un réseau PPI de gène TF, de micro-ARN et de tissu spécifique des sept RBP hub. Le réseau spécifique au gène TF comprenait 68 nœuds, 152 arêtes et 7 graines (PTBP1, PPIH, SMAD5, MSI2, RBM15, MRPS17 et ADAT3) (Figure 7A), réseau spécifique au gène miARN 36 nœuds, 64 bords et 4 graines (MRPS17, MSI2, SMAD5 et PTBP1) (Figure 7B) et réseau PPI spécifique aux tissus 14 nœuds, 19 arêtes et 5 graines (PPIH, RBM15, PTBP1, SMAD5 et MSI2) (Figure 7C).Enfin, l'analyse d'enrichissement de la fonction a révélé qu'ils étaient enrichis en modification de base d'oscillation d'ARNt, voie de signalisation médiée par la thrombopoïétine, régression du canal de Mullerian, liaison polypyrimidine et snRNP U4/U6 (figure 7D). Tous ces résultats suggèrent que les sept RBP hubs étaient largement impliqués dans de nombreux processus biologiques.

Figure 7 Réseau de biologie et fonctions des sept RBP hub. (UNE) Réseau de gènes TF. (B) réseau de gènes miARN. (C) Réseau PPI spécifique aux tissus. () Réseau d'enrichissement fonctionnel.

Évaluation de l'infiltration immunitaire tumorale

Les effets des sept RBP sur l'infiltration immunitaire tumorale ont également été explorés, dont les résultats ont démontré que l'expression de MRPS17 et PTBP1 était négativement significativement corrélée avec l'abondance des TIL. Il a également été révélé que l'expression de MRPS17 était négativement corrélée avec l'abondance des cellules Th1, des cellules Tem-CD8, des cellules NKT et des cellules NK (figure 8A). L'expression de PTBP1 s'est également révélé être négativement corrélé avec l'abondance des cellules Th1, des cellules Tem-CD4, des cellules NKT et des éosinophiles (figure 8B). Tous ces résultats indiquent que MRPS17 et PTBP1 peut réduire l'infiltration des cellules immunitaires.

Figure 8 La relation entre l'expression des RBP du hub et l'abondance des TIL. (UNE) La relation entre l'expression de MRPS17 et l'abondance des TIL. (B) La relation entre l'expression de PTBP1 et l'abondance des TIL.

La régulation à la baisse de PTBP1 Affaiblissement de la capacité de migration et d'invasion des cellules STAD

Étant donné que le rôle de PTBP1 dans STAD n'est toujours pas clair, nous avons exploré plus avant l'effet de PTBP1 sur la capacité de migration et d'invasion des cellules STAD. PTBP1 L'expression de l'ARNm dans plusieurs lignées cellulaires STAD a été détectée par RT-PCR (figure 9A). Par la suite, les ARNsi (si-NC, si-1 et si-2) ont été transfectés dans des cellules AGS et HGC27. Les tests RT-PCR et Western Blot ont montré que PTBP1 l'expression était significativement régulée à la baisse dans les cellules STAD (AGS et HGC27) transfectées avec si-1 ou si-2 par rapport à celles transfectées avec si-NC (figure 9B). Ensuite, il a été prouvé par des tests transwell que la migration et l'invasion de l'AGS (p&# x003C0.01, figure 9C) et HGC27 (p&# x003C0.01, figure 9D) étaient considérablement réduites par knockdown de PTBP1. Par conséquent, nous pourrions en déduire que PTBP1 joué un rôle important dans la promotion des métastases de STAD.

Figure 9 La régulation négative de PTBP1 a affaibli la capacité de migration et d'invasion des cellules STAD. (UNE) Niveau d'expression de l'ARNm de PTBP1 dans les cellules STAD. (B) Les cellules knockdown AGS et HGC27 PTBP1 ont été construites puis confirmées par RT-PCR et Western blot. (C, ) La capacité de migration et d'invasion des cellules AGS et HGC27 était considérablement affaiblie par la régulation négative de PTBP1. (**pπ 0.01, ***p π.001).


Ahringer, J., et Kimble, J. (1991). Contrôle du commutateur spermatozoïde dans Caenorhabditis elegans hermaphrodites par le fem-3 3' région non traduite. La nature 349 , 346�. Article abstrait

Ambros, V. (2003). Voies des microARN chez les mouches et les vers : croissance, mort, graisse, stress et timing. Cellule 113 , 673�. Article abstrait

Barbee, S.A., Lublin, A.L. et Evans, T.C. (2002). Une nouvelle fonction pour les protéines Sm dans la localisation des grains germinaux au cours C. elegans embryogenèse. Cour. Biol. 12 , 1502�. Article abstrait

Bartel, D.P. (2004). MicroARN : génomique, biogenèse, mécanisme et fonction. Cellule 116 , 281�. Article abstrait

Brown, V., Jin, P., Ceman, S., Darnell, J.C., O'Donnell, W.T., Tenenbaum, S.A., Jin, X., Feng, Y., Wilkinson, K.D., Keene, J.D., et al. (2001). Identification par microarray d'ARNm cérébraux associés à FMRP et de profils de traduction d'ARNm altérés dans le syndrome de l'X fragile. Cellule 107 , 477�. Article abstrait

Ciosk, R., DePalma, M. et Priess, J.R. (2004). ATX-2, le C. elegans orthologue de l'ataxine 2, fonctionne dans la régulation traductionnelle dans la lignée germinale. Développement 131 , 4831�. Article abstrait

Clifford, R., Lee, M.H., Nayak, S., Ohmachi, M., Giorgini, F. et Schedl, T. (2000). FOG-2, une nouvelle protéine contenant une F-box, s'associe à la protéine de liaison à l'ARN GLD-1 et dirige la détermination du sexe masculin dans le C. elegans lignée germinale hermaphrodite. Développement 127 , 5265�. Résumé

Crittenden, S.L., Bernstein, D.S., Bachorik, J.L., Thompson, B.E., Gallegos, M., Petcherski, A.G., Moulder, G., Barstead, R., Wickens, M. et Kimble, J. (2002). Une protéine de liaison à l'ARN conservée contrôle les cellules souches germinales dans Caenorhabditis elegans . La nature 417 , 660�. Article abstrait

Curtis, D., Lehmann, R. et Zamore, P.D. (1995). Régulation translationnelle en développement. Cellule 81 , 171󈞺. Article abstrait

de Moor, C.T., et Richter, J.D. (2001). Contrôle translationnel dans le développement des vertébrés. Dans Spécification de la lignée cellulaire et structuration de l'embryon, L.D. Etkin et K.W. Jeon, éd. (San Diego, Academic Press), pp. 567–8211608. Résumé

Detwiler, M.R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E. et Lin, R. (2001). Deux protéines à doigt de zinc, OMA-1 et OMA-2, sont redondantes nécessaires à la maturation des ovocytes dans C. elegans . Dév. Cellule 1 , 187�. Article abstrait

Draper, B.W., Mello, C.C., Bowerman, B., Hardin, J. et Priess, J.R. (1996). MEX-3 est une protéine du domaine KH qui régule l'identité du blastomère au début C. elegans embryons. Cellule 87 , 205�. Article abstrait

Eckmann, C.R., Crittenden, S.L., Suh, N. et Kimble, J. (2004). GLD-3 et contrôle de la décision mitose/méiose dans la lignée germinale de Caenorhabditis elegans . La génétique 168 , 147�. Article abstrait

Eckmann, C.R., Kraemer, B., Wickens, M. et Kimble, J. (2002). GLD-3, un homologue bicaudal-C qui inhibe la FBF pour contrôler la détermination du sexe de la lignée germinale chez C. elegans . Dév. Cellule 3 , 697�. Article abstrait

Francis, R., Barton, M.K., Kimble, J. et Schedl, T. (1995a). gld-1 , un gène suppresseur de tumeur nécessaire au développement des ovocytes chez Caenorhabditis elegans . La génétique 139 , 579�. Résumé

Francis, R., Maine, E., et Schedl, T. (1995b). Analyse des multiples rôles de gld-1 dans le développement de la lignée germinale : interactions avec la cascade de détermination du sexe et la glp-1 voie de signalisation. La génétique 139 , 607�. Résumé

Fribourg, S., Gatfield, D., Izaurralde, E. et Conti, E. (2003). Un nouveau mode de reconnaissance des protéines RBD dans le complexe Y14-Mago. Nat. Structurer. Biol. 10 , 433�. Article abstrait

Fujita, M., Hawkinson, D., King, K.V., Hall, D.H., Sakamoto, H. et Buechner, M. (2003). Le rôle de l'homologue ELAV EXC-7 dans le développement de la Caenorhabditis elegans canaux excréteurs. Dév. Biol. 256 , 290�. Article abstrait

Gibert, M.A., Starck, J. et Beguet, B. (1984). Rôle du noyau cytoplasmique de la gonade lors de l'ovogenèse du nématode Caenorhabditis elegans . Biol. Cellule 50 , 77󈟁. Résumé

Gomes, J.E., Encalada, S.E., Swan, K.A., Shelton, C.A., Carter, J.C. et Bowerman, B. (2001). Le gène maternel spn-4 code une protéine RRM prédite requise pour l'orientation du fuseau mitotique et la structuration du destin cellulaire au début C. elegans embryons. Développement 128 , 4301�. Résumé

Goodwin, E.B., Okkema, P.G., Evans, T.C. et Kimble, J. (1993). Régulation translationnelle de tra-2 par sa région 3' non traduite contrôle l'identité sexuelle dans C. elegans . Cellule 75 , 329�. Article abstrait

Grishok, A., Pasquinelli, A.E., Conte, D., Li, N., Parrish, S., Ha, I., Baillie, D.L., Fire, A., Ruvkun, G. et Mello, C.C. (2001). Les gènes et les mécanismes liés à l'interférence ARN régulent l'expression des petits ARN temporels qui contrôlent C. elegans chronologie du développement. Cellule 106 , 23󈞎. Article abstrait

Gruidl, M.E., Smith, P.A., Kuznicki, K.A., McCrone, J.S., Kirchner, J., Roussell, D.L., Strome, S. et Bennett, K.L. (1996). De multiples hélicases potentielles de lignée germinale sont des composants des granules P spécifiques à la lignée germinale de Caenorhabditis elegans . Proc. Natl. Acad. Sci. Etats-Unis 93 , 13837�. Article abstrait

Hansen, D., Wilson-Berry, L., Dang, T. et Schedl, T. (2004). Contrôle de la décision de prolifération versus développement méiotique dans le C. elegans lignée germinale par la régulation de l'accumulation de la protéine GLD-1. Développement 131 , 93�. Article abstrait

Huang, N.N., Mootz, D.E., Walhout, A.J., Vidal, M. et Hunter, C.P. (2002). Les protéines interagissant avec MEX-3 lient la polarité cellulaire à l'expression génique asymétrique dans Caenorhabditis elegans . Développement 129 , 747�. Résumé

Jan, E., Motzny, C.K., Graves, L.E. et Goodwin, E.B. (1999). La protéine STAR, GLD-1, est un régulateur traductionnel de l'identité sexuelle chez C. elegans . EMBO J. 18 , 258�. Article abstrait

Jin, S.W., Arno, N., Cohen, A., Shah, A., Xu, Q., Chen, N. et Ellis, R.E. (2001a). Dans Caenorhabditis elegans , les domaines de liaison à l'ARN de la protéine de liaison à l'élément de polyadénylation cytoplasmique FOG-1 sont nécessaires pour réguler le destin des cellules germinales. La génétique 159 , 1617�. Article abstrait

Jin, S.W., Kimble, J. et Ellis, R.E. (2001b). Régulation du destin cellulaire dans Caenorhabditis elegans par une nouvelle protéine de liaison à l'élément de polyadénylation cytoplasmique. Dév. Biol. 229 , 537�. Article abstrait

Johnstone, O., et Lasko, P. (2001). Régulation traductionnelle et localisation d'ARN dans Drosophile ovocytes et embryons. Annu. le révérend Genet. 35 , 365�. Article abstrait

Jones, A.R., et Schedl, T. (1995). mutations dans gld-1 , un gène suppresseur de tumeur spécifique aux cellules germinales femelles dans Caenorhabditis elegans , affectent un domaine conservé également trouvé dans la protéine associée à Src Sam68. Gènes Dev. 9 , 1491�. Résumé

Karashima, T., Sugimoto, A. et Yamamoto, M. (2000). Caenorhabditis elegans l'homologue du facteur d'azoospermie humain DAZ est requis pour l'oogenèse mais pas pour la spermatogenèse. Développement 127 , 1069�. Résumé

Kataoka, N., Yong, J., Kim, V.N., Velazquez, F., Perkinson, R.A., Wang, F. et Dreyfuss, G. (2000). L'épissage pré-ARNm imprime l'ARNm dans le noyau avec une nouvelle protéine de liaison à l'ARN qui persiste dans le cytoplasme. Mol. Cellule 6 , 673�. Article abstrait

Kawano, T., Kataoka, N., Dreyfuss, G. et Sakamoto, H. (2004). Ce-Y14 et MAG-1, composants du complexe de jonction exon-exon, sont nécessaires à l'embryogenèse et à la commutation sexuelle de la lignée germinale chez Caenorhabditis elegans . Méca. Dév. 121 , 27󈞏. Article abstrait

Kawasaki, I., Shim, Y.H., Kirchner, J., Kaminker, J., Wood, W.B. et Strome, S. (1998). PGL-1, un composant de liaison à l'ARN prédit des granules germinales, est essentiel pour la fertilité chez C. elegans . Cellule 94 , 635�. Article abstrait

Kelly, W.G., Schaner, C.E., Dernburg, A.F., Lee, M.H., Kim, S.K., Villeneuve, A.M. et Reinke, V. (2002). Silençage du chromosome X dans la lignée germinale de C. elegans . Développement 129 , 479�. Résumé

Ketting, R.F., Fischer, S.E., Bernstein, E., Sijen, T., Hannon, G.J. et Plasterk, R.H. (2001). Dicer fonctionne dans l'interférence ARN et dans la synthèse de petits ARN impliqués dans la synchronisation du développement chez C. elegans . Gènes Dev. 15 , 2654�. Article abstrait

Kiehl, T.R., Shibata, H. et Pulst, S.M. (2000). L'orthologue de l'ataxine-2 humaine est essentielle pour la structuration embryonnaire précoce chez C. elegans . J. Mol. Neurosques. 15 , 231�. Article abstrait

Knight, S.W., et Bass, B.L. (2001). Un rôle de l'enzyme RNase III DCR-1 dans l'interférence ARN et le développement de la lignée germinale chez Caenorhabditis elegans . Science. 293 , 2269�. Article abstrait

Kraemer, B., Crittenden, S., Gallegos, M., Moulder, G., Barstead, R., Kimble, J. et Wickens, M. (1999). Les protéines NANOS-3 et FBF interagissent physiquement pour contrôler la commutation spermatozoïde dans Caenorhabditis elegans . Cour. Biol. 9 , 1009�. Article abstrait

Kuersten, S., et Goodwin, E.B. (2003). La puissance de l'UTR 3' : contrôle et développement traductionnels. Nat. le révérend Genet. 4 , 626�. Article abstrait

Kuznicki, K.A., Smith, P.A., Leung-Chiu, W.M., Estevez, A.O., Scott, H.C. et Bennett, K.L. (2000). L'interférence d'ARN combinatoire indique que GLH-4 peut compenser GLH-1 ces deux composants de granule P sont critiques pour la fertilité dans C. elegans . Développement 127 , 2907�. Résumé

Lamont, L.B., Crittenden, S.L., Bernstein, D., Wickens, M. et Kimble, J. (2004). FBF-1 et FBF-2 régulent la taille de la région mitotique dans le C. elegans lignée germinale. Dév. Cellule 7 , 697�. Article abstrait

Lee, M.H. et Schedl, T. (2001). Identification de in vivo Cibles d'ARNm de GLD-1, un motif maxi-KH contenant la protéine requise pour C. elegans développement des cellules germinales. Gènes Dev. 15 , 2408�. Article abstrait

Lee, M.H., et Schedl, T. (2004). La répression de la traduction par GLD-1 protège ses cibles d'ARNm de la désintégration de l'ARNm non-sens dans C. elegans . Gènes Dev. 18 , 1047�. Article abstrait

Loria, P.M., Duke, A., Rand, J.B. et Hobert, O. (2003). Deux protéines neuronales de liaison à l'ARN localisées dans le noyau impliquées dans la transmission synaptique. Cour. Biol. 13 , 1317�. Article abstrait

Luitjens, C., Gallegos, M., Kraemer, B., Kimble, J. et Wickens, M. (2000). Les protéines CPEB contrôlent deux étapes clés de la spermatogenèse chez C. elegans . Gènes Dev. 14 , 2596�. Article abstrait

Lundquist, E.A., Herman, R.K., Rogalski, T.M., Mullen, G.P., Moerman, D.G. et Shaw, J.E. (1996). Les mec-8 gène de C. elegans code une protéine avec deux motifs de reconnaissance d'ARN et régule l'épissage alternatif de unc-52 transcriptions. Développement 122 , 1601�. Résumé

Marin, V.A., et Evans, T.C. (2003). La répression translationnelle d'un C. elegans Notch ARNm par la protéine de domaine STAR/KH GLD-1. Développement 130 , 2623�. Article abstrait

Mello, C.C., Draper, B.W., Krause, M., Weintraub, H. et Priess, J.R. (1992). Les tarte-1 et mex-1 gènes et contrôle maternel de l'identité du blastomère au début C. elegans embryons. Cellule 70 , 163�. Article abstrait

Mello, C.C., Schubert, C., Draper, B., Zhang, W., Lobel, R. et Priess, J.R. (1996). La spécification de la protéine PIE-1 et de la lignée germinale dans C. elegans embryons. La nature 382 , 710�. Article abstrait

Milne, C.A. et Hodgkin, J. (1999). ETR-1, un homologue d'une protéine liée à la dystrophie myotonique, est essentiel pour le développement musculaire chez Caenorhabditis elegans . Cour. Biol. 9 , 1243�. Article abstrait

Mootz, D., Ho, D.M. et Hunter, C.P. (2004). La protéine du domaine STAR/Maxi-KH GLD-1 médie un changement de développement dans le contrôle traductionnel de C. elegans PAL-1. Développement 131 , 3263�. Article abstrait

Moss, E.G., Lee, R.C. et Ambros, V. (1997). La protéine du domaine de choc froid LIN-28 contrôle la synchronisation du développement dans C. elegans et est réglementé par le lin-4 ARN. Cellule 88 , 637�. Résumé

Moss, E.G. et Tang, L. (2003). Conservation du régulateur hétérochronique Lin-28, de son expression développementale et des sites complémentaires des microARN. Dév. Biol. 258 , 432�. Article abstrait

Nicoll, M., Akerib, C.C. et Meyer, B.J. (1997). Mécanismes de comptage des chromosomes X qui déterminent le sexe des nématodes. La nature 388 , 200�. Article abstrait

Ogura, K., Kishimoto, N., Mitani, S., Gengyo-Ando, ​​K. et Kohara, Y. (2003). Contrôle translationnel de la mère glp-1 ARNm par POS-1 et sa protéine d'interaction SPN-4 dans Caenorhabditis elegans . Développement 130 , 2495�. Article abstrait

Puoti, A., et Kimble, J. (1999). Les Caenorhabditis elegans gène de détermination du sexe mog-1 code pour un membre de la famille des protéines DEAH-Box. Mol. Cell Biol. 19 , 2189�. Résumé

Puoti, A., et Kimble, J. (2000). La commutation spermatozoïde/ovocyte hermaphrodite nécessite la Caenorhabditis elegans homologues de PRP2 et PRP22. Proc. Natl. Acad. Sci. Etats-Unis 97 , 3276�. Article abstrait

Ryder, S.P., Frater, L.A., Abramovitz, D.L., Goodwin, E.B. et Williamson, J.R. (2004). Spécificité de la cible d'ARN de la protéine régulatrice post-transcriptionnelle du domaine STAR/GSG GLD-1. Nat. Structurer. Mol. Biol. 11 , 20󈞈. Article abstrait

Schisa, J.A., Pitt, J.N. et Priess, J.R. (2001). Analyse de l'ARN associé aux granules P dans les cellules germinales de C. elegans adultes. Développement 128 , 1287�. Résumé

Schubert, C.M., Lin, R., de Vries, C.J., Plasterk, R.H. et Priess, J.R. (2000). MEX-5 et MEX-6 fonctionnent pour établir l'asymétrie soma/germline au début C. elegans embryons. Mol. Cellule 5 , 671�. Article abstrait

Shimada, M., Kawahara, H. et Doi, H. (2002). Une nouvelle famille de protéines à doigts de zinc de type CCCH, MOE-1, -2 et -3, participe à C. elegans maturation des ovocytes. Gènes Cellules 7 , 933�. Article abstrait

Singh, G., et Lykke-Andersen, J. (2003). De nouvelles connaissances sur la formation de complexes actifs de désintégration à médiation non-sens. Tendances Biochem. Sci. 28 , 464�. Article abstrait

Skipper, M., Milne, C.A. et Hodgkin, J. (1999). Analyse génétique et moléculaire de renard-1 , un élément numérateur impliqué dans Caenorhabditis elegans détermination primaire du sexe. La génétique 151 , 617�. Résumé

Spike, C.A., Davies, A.G., Shaw, J.E. et Herman, R.K. (2002).MEC-8 réglemente l'épissage alternatif de unc-52 transcriptions dans C. elegans cellules hypodermiques. Développement 129 , 4999�. Résumé

Subramaniam, K., et Seydoux, G. (1999). nos-1 et nos-2 , deux gènes liés à Nanos de drosophile , régulent le développement et la survie des cellules germinales primordiales dans Caenorhabditis elegans . Développement 126 , 4861�. Résumé

Subramaniam, K., et Seydoux, G. (2003). Dédifférenciation des spermatocytes primaires en tumeurs germinales chez C. elegans dépourvu de la protéine de type pumilio PUF-8. Cour. Biol. 13 , 134�. Article abstrait

Tabara, H., Hill, R.J., Mello, C.C., Priess, J.R. et Kohara, Y. (1999a). pos-1 code pour une protéine cytoplasmique à doigt de zinc essentielle à la spécification de la lignée germinale dans C. elegans . Développement 126 , 1󈝷. Résumé

Tabara, H., Sarkissian, M., Kelly, W.G., Fleenor, J., Grishok, A., Timmons, L., Fire, A. et Mello, C.C. (1999b). Les rde-1 gène, ARN interférence et transposon silençage dans C. elegans . Cellule 99 , 123�. Article abstrait

Tabara, H., Yigit, E., Siomi, H. et Mello, C.C. (2002). La protéine de liaison à l'ARNdb RDE-4 interagit avec RDE-1, DCR-1 et une hélicase à boîte DExH pour diriger l'ARNi dans C. elegans . Cellule 109 , 861�. Article abstrait

Tenenbaum, S.A., Carson, C.C., Lager, P.J. et Keene, J.D. (2000). Identification de sous-ensembles d'ARNm dans des complexes de ribonucléoprotéines messagères à l'aide de puces à ADNc. Proc. Natl. Acad. Sci. Etats-Unis 97 , 14085�. Article abstrait

Tenenbaum, S.A., Lager, P.J., Carson, C.C. et Keene, J.D. (2002). Ribonomique : identification de sous-ensembles d'ARNm dans des complexes mRNP à l'aide d'anticorps dirigés contre des protéines de liaison à l'ARN et des puces génomiques. Méthodes 26 , 191�. Article abstrait

Tenenhaus, C., Subramaniam, K., Dunn, M.A. et Seydoux, G. (2001). PIE-1 est une protéine bifonctionnelle qui régule l'expression des gènes maternels et zygotiques dans la lignée germinale embryonnaire de Caenorhabditis elegans . Gènes Dev. 15 , 1031�. Article abstrait

Tijsterman, M., Okihara, K.L., Thijssen, K. et Plasterk, R.H. (2002). PPW-1, une protéine PAZ/PIWI requise pour l'ARNi efficace de la lignée germinale, est défectueuse dans un isolat naturel de C. elegans . Cour. Biol. 12 , 1535�. Article abstrait

Wang, L., Eckmann, C.R., Kadyk, L.C., Wickens, M. et Kimble, J. (2002). Une poly(A) polymérase cytoplasmique régulatrice dans Caenorhabditis elegans . La nature 419 , 312�. Article abstrait

Wickens, M., Bernstein, D., Crittenden, S., Luitjens, C. et Kimble, J. (2001). Protéines PUF et régulation 3'UTR dans le Caenorhabditis elegans lignée germinale. Harb de printemps froid. Symp. Quant. Biol. 66 , 337�. Article abstrait

Wickens, M., Goodwin, E.B., Kimble, J., Strickland, S. et Hentze, M.W. (2000). Contrôle translationnel des décisions de développement. Dans Translational control of gene expression, N. Sorenberg, J.W.B. Hershey et M.B. Matthieu, éd. (Cold Spring Harbor : Cold Spring Harbor Laboratory Press), pp. 295 & 8211370.

Xu, L., Paulsen, J., Yoo, Y., Goodwin, E.B. et Strome, S. (2001). Caenorhabditis elegans MES-3 est une cible de GLD-1 et fonctionne de manière épigénétique dans le développement de la lignée germinale. La génétique 159 , 1007�. Résumé

Yoda, A., Sawa, H. et Okano, H. (2000). MSI-1, une protéine neuronale de liaison à l'ARN, est impliquée dans le comportement d'accouplement des mâles chez Caenorhabditis elegans . Gènes Cellules 5 , 885�. Article abstrait

Zhang, B., Gallegos, M., Puoti, A., Durkin, E., Fields, S., Kimble, J. et Wickens, M.P. (1997). Une protéine de liaison à l'ARN conservée qui régule les destins sexuels dans le C. elegans lignée germinale hermaphrodite. La nature 390 , 477�. Article abstrait

* Edité par Thomas Blumenthal. Dernière révision le 8 février 2005. Publié le 18 avril 2006. Ce chapitre doit être cité comme suit : Lee, M.-H. et Schedl, T. RNA-binding protein (18 avril 2006), Livre de vers , éd. Les C. elegans Communauté de recherche, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.79.1, http://www.wormbook.org.

Droits d'auteur: &copier 2006 Min-Ho Lee et Tim Schedl. Il s'agit d'un article en libre accès distribué selon les termes de la licence d'attribution Creative Commons, qui permet une utilisation, une distribution et une reproduction sans restriction sur n'importe quel support, à condition que l'auteur et la source d'origine soient crédités.

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