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Problèmes de cytométrie en flux

Problèmes de cytométrie en flux



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J'ai des problèmes avec l'analyse des données ici.

J'ai des données de cytométrie en flux collectées sur un Fortessa, et lorsque je les importe dans FlowJo 8.7, toutes mes valeurs de fluorescence sont systématiquement 10 fois inférieures à celles du cytomètre. Aucune idée de ce qui se passe ici, quelqu'un peut-il m'aider ? Si vous voulez des captures d'écran et des photos des données, je suis heureux de les publier.


J'ai aussi ce problème avec les données d'un Partec PAS III. Je ne considère pas cela comme un problème, car c'est vraiment juste l'axe des x qui est un ordre de grandeur plus élevé. Au final, toutes les valeurs provenant de la machine sont des valeurs arbitraires, donc tant que le changement est systématique, il n'y a pas de problème.


La réponse à laquelle je suis arrivé est la différence entre les fichiers FCS2.0 et FCS3.0. Le modèle de binning est différent et, en tant que tel, les fichiers FCS2.0 ont arbitrairement abaissé mes valeurs de cytométrie en flux par rapport à ce que j'ai vu sur le logiciel FACS DiVa.

En fin de compte, l'exportation avec FCS3.0 était la voie à suivre. Si votre logiciel prend en charge cela, je vous le recommande vivement !


Problèmes de cytométrie en flux - Biologie

Description de l'installation
Installation FACS
L'installation de cytométrie en flux est située au neuvième étage, aile est du bâtiment Hunter North. Cette installation peut fournir des analyses de jusqu'à 7 paramètres dans des populations de cellules eucaryotes et trier les cellules dans des conditions stériles. Ces analyses peuvent être utilisées pour identifier et isoler des populations de cellules rares, déterminer la ploïdie chromosomique dans des cellules individuelles, étudier l'apoptose et étudier la signalisation cellulaire, entre autres applications.

La formation des utilisateurs du FACSCalibur (Becton-Dickinson Biosciences) et l'assistance à son fonctionnement sont disponibles, sur rendez-vous, par l'intermédiaire du responsable de l'installation. Une formation périodique des utilisateurs sur le FACSCalibur est également assurée par le biais de séminaires spécialisés.

Le FACSVantage (Becton-Dickinson Biosciences) est exploité uniquement par le gestionnaire de l'installation. Le gestionnaire et le directeur de projet sont disponibles pour discuter des projets et conseiller les enquêteurs sur les demandes pertinentes à leur projet.

Instruments

Cytomètre en flux FACSCalibur

FACSCalibur est un analyseur de paillasse composé d'argon, d'un laser refroidi à l'air émettant à 488 nm et d'une diode laser à 633 nm. Il peut fournir des analyses jusqu'à 6 paramètres et jusqu'à 4 couleurs.

Cytomètre en flux FACSVantage

FACSVantage est un trieur composé d'un laser refroidi à l'hélium-néon (HeNe) émettant à 633 nm et d'un laser Enterprise II refroidi à l'eau émettant à la fois à 488 nm et à l'ultraviolet (UV). Il peut fournir des analyses jusqu'à 7 paramètres et jusqu'à 5 couleurs.

Règles de fonctionnement
Règles et règlements

1. Prenez rendez-vous pour utiliser l'équipement au moins une semaine à l'avance.

2. L'utilisation de l'équipement est limitée à une période de 2 heures par laboratoire et par jour, sauf si des dispositions spéciales sont autorisées. Les utilisateurs doivent informer l'établissement de toute annulation au moins 6 heures à l'avance. Pour le FACSVantage, des frais d'installation seront facturés pour un rendez-vous manqué.

3. Signez le journal de bord qui est placé à côté de tous les instruments.

4. Après chaque session sur le FACSCalibur, suivez la procédure de nettoyage de l'instrument.

5. Le chercheur principal de chaque laboratoire sera responsable de son personnel de laboratoire.

6. Signalez tout problème au gestionnaire dès que possible.

Précautions de sécurité
Sécurité

1. Lasers

une. FACSCaliubr est équipé d'un laser Argon refroidi à l'air émettant à 488 nm et d'un laser Diode émettant à 633 nm. Bien que les lasers soient enfermés, la lumière peut être visible (avec difficulté) si le couvercle est ouvert. Ne regardez pas la lumière laser. Cela peut endommager vos yeux.

b. FACSVantage est équipé de lasers Enterprise et HeNe refroidis à l'eau, qui sont visibles lorsque l'instrument est en fonctionnement. Personne n'est autorisé dans la salle sans la présence du Facility Manager pendant que l'instrument est en fonctionnement.


2. Échantillons : Selon les échantillons de l'investigateur, il faut porter un vêtement de protection approprié (gants en latex, blouses de laboratoire, écran facial, etc.). Aucun matériel nécessitant BL2 ne doit être apporté à l'installation. Des gants en latex doivent être utilisés lors du changement de fluide dans le FACSCalibur.


Horaires de service et formulaires requis
Frais de service de l'installation FACS

Utilisation de FACSCalibur : 10,00 $ par heure

(frais minimum de 10$ pour chaque utilisation)

Utilisation FACSVantage : 20,00 $ par heure + frais d'installation de 20,00 $ (par jour) (1/2 h minimum)


Problèmes de cytométrie en flux avec les agrégats cellulaires/l'agglutination lors de l'utilisation de cellules T

J'utilise régulièrement la cytométrie en flux avec divers types de cellules, mais j'ai surtout utilisé des cellules adhérentes jusqu'à récemment. Avec des cellules adhérentes, je dois traiter avec de l'EDTA ou de la Trypsine-EDTA pour détacher les cellules avant de les colorer/fixer de toute façon, elles finissent donc généralement sous la forme d'une suspension unicellulaire assez propre, surtout si je pipette vigoureusement ou si je passe les cellules à travers un filet de nylon. filtre. Ayant récemment commencé à utiliser des cellules qui se développent en suspension, telles que les cellules T (CEM-ss, SupT1, PBMC), j'ai remarqué qu'elles sont plus susceptibles de former des agrégats, ce qui interfère avec mon dosage.

Il est extrêmement important de savoir que j'ai bien une suspension unicellulaire, pas de doublets, car je recherche la formation de syncytia, qui sur un cytomètre en flux apparaissent avec un profil FSC/SSC très similaire aux doublets, c'est-à-dire qu'ils sont gros ( FSC-A élevé) et ont des formes inhabituelles (FSC-W élevé) et une granularité (SSC élevé) que la plupart des gens excluraient généralement de leur analyse - je dois en fait conserver ces événements FSC/SSC inhabituels dans mon analyse, mais je dois exclure les doublets ou les triplets, de sorte que cela ne peut pas être simplement fait par la synchronisation FSC/SSC. J'essaie d'optimiser mon contrôle négatif (où il n'y a pas de syncytia) afin d'obtenir un signal propre sur lequel je puisse détecter les syncytia en recherchant des cellules avec un FSC/SSC élevé, ou en ayant deux populations cellulaires étiquetées avec différents colorants cytoplasmiques colorés et recherche de cellules doublement positives. De toute évidence, les agrégats cellulaires interfèrent avec ces deux mesures et il est vraiment important pour moi d'avoir un contrôle négatif propre.

Juste pour expliquer rapidement la procédure, je transfère les cellules T (qui poussent dans du RPMI 1640 avec 10 % de FBS) dans des tubes FACS à fond rond de 5 ml. Je les centrifuge pendant 5 minutes à 500 g, décante le surnageant et resuspend dans 200 ul de RPMI sans sérum contenant de la DNase. Après 10 minutes à température ambiante (et une agitation douce), j'ajoute 200 ul de PBS/8% PFA (4% final) pour fixer. 10 minutes plus tard, j'ajoute 1,5 ml de PBS/1% BSA, centrifuger 5 minutes à 1500 g, décanter le surnageant, et remettre en suspension dans du PBS avant analyse par cytométrie en flux. (Dans certains cas, il y a des étapes de marquage des anticorps après cela, mais j'ai déterminé que les agrégats sont présents immédiatement après la fixation ou même avant, donc je ne pense pas que ces étapes soient pertinentes).

Voici les choses que j'ai essayées et comment elles se sont avérées :

Trypsine-EDTA : Si après la première centrifugation, avant l'étape de DNase, je traite avec de la Trypsine-EDTA (la solution typique que vous utiliseriez pour détacher les cellules adhérentes), une chose vraiment bizarre se produit : les cellules s'agglutinent immédiatement (en quelques secondes) en un énorme agrégat, qu'il est alors impossible de disperser en pipetant vigoureusement. Si j'inactive ensuite avec RPMI/FBS, centrifuge et continue le traitement à la DNase, le bloc est toujours là. J'ai également essayé de remettre les cellules en suspension dans des milieux de culture sans sérum avant d'ajouter la trypsine (pour ne pas l'ajouter sur un culot cellulaire et pour qu'elle soit diluée 1:1), mais elles s'agglutinent toujours. Honnêtement, je ne comprends pas du tout cela et personne ici n'a la moindre idée de la raison pour laquelle cela se produit, car vous vous attendez généralement à ce que la trypsine se dissocie et non qu'elle agglomère les cellules. J'ai même trouvé des articles qui mentionnent l'utilisation de la trypsine pour éliminer les doublets dans exactement le même test que je fais (c'est-à-dire la recherche de syncytia dans les cellules T), et ils ne mentionnent rien sur l'agglutination, ou toute autre étape avant ou après la trypsine que je & #x27m pas déjà fait.

Juste de l'EDTA sans trypsine : cela fait un moment que je n'ai pas essayé cela, mais je sais que cela ne provoque pas l'agglutination extrême que j'obtiens lorsque j'utilise de la trypsine-EDTA. Pourtant, les doublets sont là dans mon contrôle négatif.

Filtre à mailles de nylon : Après l'étape DNase, et avant d'ajouter le fixateur, j'ai également essayé de faire passer les cellules à travers une maille de nylon de 50 um. Bien que cela réduise définitivement le nombre de doublets/agrégats apparaissant sur le cytomètre en flux (dans mon contrôle sans syncytia), ils sont toujours là. De plus, comme les syncytia que je m'attends à voir peuvent facilement avoir un diamètre de 50 um ou plus, je ne veux pas qu'ils soient exclus par le filtre ou lysés par celui-ci. Fondamentalement, l'utilisation d'une étape de filtration à taille définie biaise mon expérience et je préfère l'éviter (outre le fait qu'elle ne semble pas se débarrasser complètement des agrégats).

A ce stade, je suis à court d'idées. Je viens de commander un échantillon d'Accutase à essayer, mais je suppose que cela fonctionnera de manière assez similaire à la trypsine car il ne s'agit en réalité que d'une protéase (à moins que quelqu'un n'ait l'habitude de l'utiliser pour briser les agrégats de cellules T ?). Mon soupçon est que les agrégats se forment non pas en raison de liaisons cellule-cellule à base de protéines (ce contre quoi la trypsine et l'EDTA sont bons), et non en raison de l'ADN extracellulaire (puisque je l'élimine avec la DNase) mais en raison des sucres de la surface cellulaire (glycanes). Cependant, je ne connais aucune méthode de routine pour neutraliser ou éliminer les glycanes.

TLDR : les cellules T sont très collantes, ce qui est mauvais pour mon test basé sur le flux pour détecter des éléments qui ressemblent à des agrégats mais qui ne le sont pas. La trypsine aggrave les choses. AIDER.


MIFlowCyt-EV : un cadre pour la notification standardisée des expériences de cytométrie en flux de vésicules extracellulaires

Les vésicules extracellulaires (VE) sont petites, hétérogènes et difficiles à mesurer. La cytométrie en flux (FC) est une technologie clé pour la mesure des particules individuelles, mais son application à l'analyse des véhicules électriques et d'autres particules submicroniques a présenté de nombreux défis et a produit un certain nombre de résultats controversés, en partie en raison des limites de la détection des instruments, manque de méthodes robustes et ambiguïtés sur la façon dont les données doivent être interprétées. Ces complications sont exacerbées par l'absence d'un cadre de rapport solide sur le terrain, et de nombreux manuscrits EV-FC incluent des descriptions incomplètes des méthodes et des résultats, contiennent des artefacts résultant d'une sensibilité insuffisante de l'instrument et d'une conception expérimentale inappropriée et manquent d'étalonnage et de normalisation appropriés. Pour résoudre ces problèmes, un groupe de travail (GT) de chercheurs EV-FC de l'ISEV, de l'ISAC et de l'ISTH, a travaillé ensemble en tant que GT EV-FC et a développé un cadre de consensus pour les informations minimales qui devraient être fournies concernant l'EV-FC. Ce cadre intègre les directives existantes d'informations minimales pour les études sur les véhicules électriques (MISEV) et la norme d'informations minimales sur une expérience FC (MIFlowCyt) dans un cadre de rapport spécifique à EV-FC (MIFlowCyt-EV) qui prend en charge la communication d'informations critiques liées à la coloration des échantillons. , détection et mesure EV et conception expérimentale dans les manuscrits qui rapportent les données EV-FC. MIFlowCyt-EV fournit une structure pour partager les résultats EV-FC, mais il ne prescrit pas de protocoles spécifiques, car il continuera à y avoir une évolution rapide des instruments et des méthodes dans un avenir prévisible. MIFlowCyt-EV s'adapte à cette évolution, tout en fournissant les informations nécessaires pour évaluer et comparer différentes approches. Étant donné que MIFlowCyt-EV garantira la cohérence dans la manière de rapporter les études EV-FC, nous prévoyons qu'avec le temps, l'adoption de MIFlowCyt-EV comme norme de rapport des études EV-FC améliorera la capacité à comparer quantitativement les résultats de différents laboratoires et à soutenir le développement de nouveaux instruments et tests pour une meilleure mesure des véhicules électriques.

Mots clés: Cadre de cytométrie en flux des vésicules extracellulaires rapportant la normalisation.

© 2020 L'auteur(s). Publié par Informa UK Limited, sous le nom de Taylor & Francis Group au nom de The International Society for Extracellular Vesicles.

Les figures

Présentation du MIFlowCyt EV…

Présentation du cadre de reporting MIFlowCyt EV. La colonne de gauche montre chaque catégorie…

Présentation du MIFlowCyt EV…

Présentation du cadre de reporting MIFlowCyt EV. La colonne de gauche montre chaque catégorie…

Résumé d'un sondage sur le fonctionnement de la cytométrie en flux (FCM) des vésicules extracellulaires (EV)…

Résumé d'un sondage sur le fonctionnement de la cytométrie en flux (FCM) des vésicules extracellulaires (EV)…

(a) Exemple de tracé de rapport…

(a) Exemple de tracé de rapport de données de dilutions en série, avec nombre d'événements par seconde…

(a) Exemple de tracé de rapport…

(a) Exemple de tracé de rapport de données de dilutions en série, avec nombre d'événements par seconde…


Meilleures pratiques pour la cytométrie en flux multiparamétrique

La cytométrie en flux est une technologie quantitative élégante, permettant l'interrogation de cellules individuelles parmi des dizaines de milliers voire des millions de cellules en quelques minutes. Les avantages de la cytométrie en flux multiparamétrique incluent la capacité de sonder des cellules individuelles avec plusieurs marqueurs fonctionnels, de corréler les niveaux d'expression des protéines à l'aide de plusieurs anticorps et, finalement, de définir plus précisément les populations cellulaires. Cependant, l'augmentation du nombre de cibles et de fluorophores augmente également la complexité de l'expérience et nécessite une plus grande attention à l'optimisation du détecteur, à la conception du panneau, aux commandes et à d'autres détails de configuration. Nous décrivons ici quelques meilleures pratiques pour concevoir une expérience de cytométrie en flux multiparamétrique. Bien qu'ils ne soient pas exhaustifs, ils englobent certaines des caractéristiques les plus importantes d'une bonne configuration expérimentale et d'une bonne conception de panneaux [1,2].

Marche de tension pour des données de la plus haute qualité

Les fabricants de cytomètres fournissent un test de performance qui certifie que l'instrument fonctionne de manière optimale par rapport à un ensemble précis de spécifications. L'optimisation du détecteur va encore plus loin dans ce processus, permettant d'obtenir des données de la plus haute qualité dans chaque canal de cytomètre en flux. Pour chaque détecteur, la tension (ou le gain) choisie doit fournir la meilleure séparation entre les signaux positifs et négatifs et garantir que toutes les mesures se situent dans la plage linéaire du détecteur. En règle générale, la méthode de marche de tension (Figure 1) est utilisé pour déterminer la tension minimale requise (MVR) qui permet une résolution claire des signaux fluorescents faibles à partir du bruit de fond de l'instrument. Dans cette méthode, des billes faiblement fluorescentes sont exécutées à l'aide d'une série de paramètres de tension croissante, et la propagation du signal (ou le coefficient de variation, CV) est tracée en fonction des tensions. La diminution de la tension d'un détecteur en dessous de son MVR peut entraîner une perte de résolution des populations faibles, et l'augmentation de la tension au-dessus de son MVR ne donne aucun avantage pour la résolution de la population. Parce que cette méthode ne garantit pas que les signaux les plus brillants ne dépassent pas la limite supérieure de la plage du détecteur, des méthodes alternatives ont été développées dans lesquelles des billes ou des cellules non colorées et colorées sont utilisées pour déterminer la MVR [3,4].

Figure 1. Détermination du réglage de tension optimal pour un détecteur de cytomètre en flux à l'aide d'une marche de tension. La méthode de marche de tension illustrée utilise une seule perle de couleur dure légèrement fluorescente. Les données sont acquises à chaque incrément de réglage de tension dans un détecteur donné, et le pourcentage de coefficient de variation robuste (%rCV) et l'écart type robuste (rSD) sont exportés et tracés en fonction de la tension pour visualiser le point d'inflexion. La tension la plus basse sur la courbe %rCV avant l'augmentation de la rSD doit être utilisée pour le détecteur. Dans cet exemple, le MVR est déterminé à 300 mV (flèche).

Titrage d'anticorps dans la conception de panneaux

Le titrage des anticorps est également une technique d'optimisation importante pour la cytométrie en flux multiparamétrique et constitue le meilleur moyen de minimiser la liaison non spécifique et d'augmenter la détection du signal. Il peut également être utilisé pour minimiser la propagation des débordements, qui se produit lorsque le signal des colorants qui émettent de la fluorescence sur une large gamme de longueurs d'onde est capturé dans plusieurs détecteurs, ce qui complique l'interprétation des données. Pour effectuer un simple titrage d'anticorps, commencez par la concentration recommandée par le fabricant, effectuez des dilutions en série de 2 fois et tracez l'indice de coloration (SI), qui est une mesure de la luminosité relative d'un anticorps conjugué à un fluorophore [5]. L'IS d'un conjugué anticorps-colorant spécifique et sa propagation par débordement aideront à déterminer si une concentration de séparation (à laquelle les cellules négatives et positives présentent la plus grande différence de fluorescence) ou une concentration de saturation (à laquelle l'anticorps a saturé l'antigène disponible dans les cellules) d'anticorps doit être utilisé (Figure 2). Une concentration de séparation fournit une bonne séparation des cellules marquées par rapport aux cellules non marquées (par exemple, lors de l'identification de populations positives en pourcentage dans des expériences d'immunophénotypage), réduit l'erreur de propagation et conserve l'anticorps. La saturation des concentrations d'anticorps, parfois nécessaire pour la détection d'antigènes en faible abondance, peut entraîner une propagation accrue des débordements et des difficultés à détecter des signaux faibles dans d'autres détecteurs.

Figure 2. Exemple de titrage d'anticorps.(UNE) Les cellules ont été incubées avec des dilutions en série d'un anticorps anti-CD8 de souris conjugué à l'APC, analysées sur le cytomètre en flux Invitrogen Attune NxT et analysées à l'aide du logiciel FlowJo. Les données sont affichées sur un seul graphique pour une comparaison plus facile. Notez que l'échantillon mis en évidence dans la case 1 est la concentration de saturation d'anticorps, tandis que l'échantillon de la case 2 est la concentration de séparation. (B) L'indice de coloration (SI) a été calculé pour les données en (A) à l'aide de l'équation : (Moyenne (cellules positives) – Moyenne (cellules négatives)) / (2 x SD (cellules négatives)), et tracé en fonction de la dilution d'anticorps.

Sélection et attribution de fluorophores

L'un des plus grands défis de la cytométrie en flux multiparamétrique consiste à sélectionner les combinaisons de fluorophores et de conjugués d'anticorps qui minimisent le besoin d'ajustements de compensation et de débordement sans compromettre la qualité des données. Plus il y a de colorants inclus dans un panel de cytométrie en flux, plus il est probable que la propagation par débordement réduira la capacité de distinguer le signal spécifique d'un fluorophore en présence d'autres. Lors du choix des étiquettes fluorescentes :

  • Utilisez des fluorophores brillants avec des anticorps pour les cibles à faible abondance et des fluorophores faibles avec des anticorps pour les antigènes fortement exprimés
  • Minimiser le chevauchement spectral des fluorophores pour réduire le débordement
  • Utiliser des fluorophores spectralement distincts pour la détection de marqueurs coexprimés
  • Utilisez des fluorophores qui sont spectralement similaires pour différentes sous-populations cellulaires qui seront bloquées séparément

figure 3 montre une méthode pour visualiser l'erreur d'étalement de débordement due au chevauchement spectral. Bien que couramment utilisé, le fluorophore tandem PE-Cy®7 présente un étalement important en raison de photons de faible énergie (longueur d'onde longue), ce qui à son tour a un impact négatif sur la résolution des marqueurs fluorescents dans d'autres canaux, en particulier ceux associés à des antigènes mal exprimés. L'utilisation d'une matrice d'étalement de débordement est une autre façon de visualiser l'étalement dans tous les autres détecteurs pour un fluorophore donné [6].

Figure 3. Visualisation de l'erreur de propagation. Des échantillons à coloration unique ont été analysés sur le cytomètre en flux Invitrogen Attune NxT et analysés à l'aide du logiciel FlowJo. Les données de chaque détecteur ont été combinées en une seule parcelle. (UNE) La coloration avec le conjugué d'anticorps FITC semble robuste lorsqu'elle est analysée dans le détecteur FITC, une erreur d'étalement minimale est observée dans d'autres canaux. (B) La coloration avec PerCP-Cy®5.5 contribue à une erreur d'étalement élevée dans les canaux PE et BV711. (C) La coloration avec BD Horizon Brilliant Violet 711 (BV711) contribue à une propagation notable dans les canaux PerCP-Cy®5.5, APC et PE. (RÉ) La coloration avec PE-Cy®7 démontre une erreur d'étalement étendue dans plusieurs canaux. *Teintures BD Horizon Brilliant Violet (Becton, Dickinson and Company).

Contrôles, contrôles, contrôles

Les contrôles, par exemple les contrôles de fluorescence moins un (FMO), les contrôles de compensation et les contrôles de viabilité, sont essentiels pour évaluer les données de cytométrie en flux multiparamètres. Les contrôles FMO sont nécessaires pour définir les portes lorsque plusieurs fluorophores sont utilisés ensemble et lorsque les marqueurs sont exprimés sur un continuum. Ils aident à prendre en compte le signal introduit par tous les autres marqueurs fluorescents dans le canal en cours de déclenchement. Les contrôles FMO, qui contiennent tous les marqueurs sauf celui d'intérêt, peuvent fournir des éclaircissements pour les populations à faible densité ou étalées et peuvent aider à délimiter deux populations qui ne sont pas facilement résolues. Un contrôle de viabilité, une sonde fluorescente qui identifie spécifiquement les cellules mortes afin qu'elles puissent être correctement exclues de l'analyse des données, est également requis dans chaque panel de cytométrie en flux multiparamétrique. Les cellules mortes sont collantes et peuvent se lier de manière non spécifique aux anticorps et autres sondes, ce qui complique l'analyse (Figure 4).

Figure 4. Effets du contrôle de la viabilité sur les statistiques démographiques. L'inclusion ou l'exclusion d'un colorant de viabilité peut affecter considérablement les statistiques de population obtenues à partir d'une expérience, et la discrimination des cellules vivantes et mortes en utilisant uniquement des paramètres de diffusion peut être subjective et inexacte [7]. Dans cet exemple de Perfetto et al. [7], après application d'une grille lymphocytaire (diffusion avant vs diffusion latérale), les cellules vivantes et mortes ont été discriminées à l'aide du kit Invitrogen LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain, notez le nombre important de cellules mortes malgré une grille de diffusion. Une analyse ultérieure des cellules vivantes et des cellules mortes montre la différence dramatique dans les phénotypes apparents entre les deux populations cellulaires. Réimprimé de Perfetto SP, Chattopadhyay PK, Lamoreaux L Nguyen R, Ambrozak D, Koup RA, Roederer M (2006) Méthodes J Immunol 313:199-208, avec la permission d'Elsevier.

Directives pour la cytométrie en flux

Suivez ces bonnes pratiques pour la cytométrie en flux multiparamétrique :

  • Optimisez les réglages de tension pour chaque détecteur de cytomètre en flux
  • Titrez chaque anticorps pour des performances optimales dans le panel
  • Considérez attentivement l'association des colorants avec les cibles et minimisez la propagation des débordements
  • Utilisez FMO et les contrôles de viabilité pour régler correctement les portes

La conception du panel est un processus itératif qui nécessite de tester toutes les combinaisons et de revoir la matrice de propagation des retombées à chaque itération. Des ressources, telles que des webinaires, des cours en ligne, des informations sur les instruments et une bibliothèque de notes d'application et de protocoles, sont disponibles au Flow Cytometry Learning Center. De plus, nous avons développé le générateur de panneaux de cytométrie en flux Invitrogen (Figure 5), qui vous guide tout au long de la conception du panneau de cytométrie en flux, offrant une expérience simplifiée et personnalisable pour répondre à vos besoins.

Figure 5. Générateur de panneaux de cytométrie en flux : un outil pour tous les cytométristes en flux. Que vous soyez novice ou expert, la conception d'un panel pour la cytométrie en flux est un processus très complexe. Si vous êtes débutant, laissez le générateur de panneaux de cytométrie en flux Invitrogen réduire votre anxiété concernant la construction de panneaux en rendant l'association de marqueurs et de fluorophores rapide et simple à l'aide d'un format très visuel. Êtes-vous un expert? Ensuite, vous apprécierez d'utiliser le générateur de panneaux de cytométrie en flux pour examiner facilement les signaux spectraux et les filtres par ligne laser et vérifier les valeurs de débordement des fluorophores par canal. Avec un accès à des informations sur plus de 13 000 anticorps pour la cytométrie en flux, cet outil permet une sélection rapide des anticorps pour les panels de cytométrie en flux.


Considérations clés sur les échantillons pour la coloration par cytométrie en flux

Figure 1. Utiliser des marqueurs de lignée pour aider à définir une population rare.
A) Coloration des progéniteurs hématopoïétiques à l'aide d'un cocktail de lignées de souris BioLegend (CD3, GR1, CD11b, B220, Ter119) et d'un anticorps anti-souris CD34 dans la moelle osseuse de souris B) Gating de cellules DC humaines à l'aide d'un cocktail de lignées humaines BioLegend (CD3, CD14, CD19 , CD20, CD56) et un anticorps anti-HLA-DR humain.


Essayez d'utiliser des graphiques bivariés (dot plot ou pseudocolor plot) au lieu d'un histogramme lorsque vous gérez des populations exprimant des marqueurs trouvés sur d'autres types de cellules. Par exemple, la figure 2 montre la différence entre la stratégie de déclenchement des cellules dendritiques de souris utilisant un marqueur dendritique CD11c sur histogramme ou deux marqueurs de cellules dendritiques, CD11c et MHC Classe II, sur un tracé pseudocolor. Sur la base du tracé bivarié, le pourcentage de vrais DC (CD11 int MHCII + ) est de 1,2% et non de 4,5% comme indiqué sur l'histogramme. La différence de pourcentage entre le tracé de pseudocouleur et l'histogramme est le résultat d'une synchronisation inexacte des valeurs aberrantes (CD11c int MHCII +/-) dans l'histogramme. Pour en savoir plus sur les différentes options de traçage des données, lisez notre blog Analyse des données de cytométrie en flux I : ce que les différents tracés peuvent vous dire.

Figure 2. Gating des cellules dendritiques à l'aide d'histogrammes et de tracés bivariés

  • Les cellules myéloïdes (monocytes, macrophages, cellules dendritiques et granulocytes) expriment des récepteurs Fcγ qui peuvent se lier à la région Fc des anticorps entraînant une coloration non spécifique. Pour minimiser cette coloration non spécifique, incluez un bloqueur FcR dans votre coloration lorsque vous travaillez avec des échantillons enrichis en cellules myéloïdes (c'est-à-dire des cultures de moelle osseuse, de sang, de rate ou de différenciation in vitro de cellules myéloïdes).
  • Certains colorants en tandem, notamment PE/Dazzle™ 594, APC/Fire™ 750, PE/Cy7, PE/Cy5, PerCP/Cy5.5 et surtout APC/Cy7, peuvent se lier de manière non spécifique aux monocytes et aux macrophages indépendamment des récepteurs Fc. L'utilisation de True-Stain Monocyte Blocker™ dans la coloration par cytométrie en flux peut aider à minimiser la liaison non spécifique. Apprenez-en plus avec notre affiche scientifique.

Figure 3. Autofluorescence des populations de leucocytes observées dans le canal FITC. Sur la gauche, stratégie de déclenchement de sous-ensembles de leucocytes du sang périphérique de souris non colorés basée sur la diffusion vers l'avant et latérale. A droite, superposition d'histogrammes d'autofluorescence entre les lymphocytes (rouge), les monocytes (vert), les neutrophiles (bleu) et les éosinophiles (violet).


Discussion

Mesure de CFSE + événements comme stratégie d'évaluation de la pureté de l'échantillon

L'absence de consensus concernant les méthodes de purification des véhicules électriques reste un défi, en particulier lorsque la reproductibilité entre différentes modalités d'isolement est souhaitée. Cela limite l'utilisation des VE dans les applications cliniques et est encore compliqué par les moyens insuffisants pour mesurer la pureté des échantillons, notamment dans les échantillons biologiques complexes contenant un mélange de particules vésiculaires et non vésiculaires, comme le plasma. De multiples stratégies, telles que la mesure du rapport protéine:particule (Webber et Clayton, 2013 Maiolo et al., 2015) et de l'albumine (Baranyai et al., 2015 Veremeyko et al., 2018), ont été proposées comme paramètres de contrôle qualité pour le préparation des véhicules électriques, en particulier lorsque des méthodes d'isolement à faible spécificité sont utilisées (Théry et al., 2019). Cependant, comme ils ne fournissent pas d'informations sur la population, il n'est toujours pas clair si ces mesures peuvent refléter avec précision la pureté des préparations de véhicules électriques.

Le CFSE a jusqu'à présent été fréquemment utilisé comme stratégie pour étiqueter les véhicules électriques pour les applications FC (Pospichalova et al., 2015 Morales-Kastresana et al., 2017 Mastoridis et al., 2018 Morales-Kastresana et al., 2019). L'adéquation de différents colorants pour colorer et identifier efficacement les véhicules électriques a déjà été abordée par le groupe de Jennifer Jones (Morales-Kastresana et al., 2017). Dans un travail publié en 2017, le groupe Jones a testé plusieurs colorants, dont le CFSE et le PHK26. Alors qu'il a été démontré que PKH26 produisait des micelles ou des agrégats de 100 2013 400 nm à la fois en présence de véhicules électriques ou seul en solution, le CFSE seul n'a pas formé de tels agrégats. Ainsi, en tenant compte de cela, dans notre travail, les véhicules électriques ont été étiquetés avec CFSE. Les données présentées ici soutiennent le marquage vésiculaire avec CFSE comme moyen de déterminer le contrôle de la qualité des protocoles de purification des véhicules électriques. Comme indiqué, la majorité des particules présentes dans les échantillons purifiés par des méthodes à haute spécificité étaient CFSE + . L'utilisation d'ExoQuick ® ou d'ultracentrifugation pour l'enrichissement des véhicules électriques avant SEC a réduit la proportion de particules CFSE –. De plus, la lyse des véhicules électriques avec le détergent NP-40 a entraîné une réduction de 90 % des événements CFSE +. Ensemble, ces résultats soutiennent l'utilité de CFSE comme outil pour identifier les particules vésiculaires dans les biofluides, et donc la pertinence de notre stratégie FC pour le contrôle qualité et la comparaison quantitative des isolats de véhicules électriques préparés par différents protocoles.

Cette même approche a été utilisée pour valider l'épuisement des véhicules électriques du FBS utilisé dans notre in vitro études. Des rapports antérieurs suggèrent que des traces de véhicules électriques bovins peuvent persister dans le surnageant de FBS après les étapes d'épuisement (Shelke et al., 2014), ce qui pourrait interférer dans l'analyse des véhicules électriques à partir du milieu conditionné. Cependant, la comparaison d'un milieu sans sérum et d'un milieu contenant 10 % de FBS appauvri en VE a montré une proportion également réduite d'événements CFSE +. Cela indique que les véhicules électriques résiduels dérivés du FBS n'étaient pas suffisamment élevés pour avoir un impact sur notre analyse. Néanmoins, les futures études utilisant notre stratégie d'analyse des véhicules électriques dans un milieu conditionné devront tenir compte des événements de fond au cas par cas, en particulier lors de l'utilisation d'un faible nombre de cellules, d'un temps de conditionnement court et/ou de cellules produisant de faibles niveaux de véhicules électriques.

Les résultats présentés par d'autres indiquent que la coloration CFSE n'a pas pu marquer 100 % des véhicules électriques (van der Vlist et al., 2012 Pospichalova et al., 2015 de Rond et al., 2018). Ainsi, nous avons pensé que certains des événements CFSE – observés dans nos expériences pourraient correspondre à des véhicules électriques non colorés. Cependant, contrairement aux résultats présentés ici, dans ces études précédentes, la coloration CFSE a été réalisée dans des cellules avant (van der Vlist et al., 2012) ou pendant le conditionnement du milieu (Pospichalova et al., 2015), et les concentrations CFSE étaient de 1,6� fois inférieures (van der Vlist et al., 2012 Pospichalova et al., 2015 de Rond et al., 2018) que celles que nous avons utilisées. De plus, seulement �% des événements dans les échantillons purifiés par ultracentrifugation différentielle couplée à un coussin de saccharose (UC-I) étaient CFSE-, et le traitement des véhicules électriques avec le détergent NP-40 a entraîné une réduction de 90% des événements CFSE + , indiquant que ce colorant marque la majorité des véhicules électriques dans nos paramètres expérimentaux. Bien que cela puisse toujours suggérer que le CFSE n'est pas capable de colorer tous les véhicules électriques présents dans l'échantillon, on ne sait toujours pas dans quelle mesure même les méthodes d'isolement de haute pureté peuvent fournir des préparations pures à 100 % des véhicules électriques. Bien que indésirable, une agrégation de protéines peut être présente dans les préparations d'anticorps. Cela est principalement dû aux conditions de la solution, telles que la force ionique, le pH, la température, la pression et les excipients (Manning et al., 1995), et les propriétés intrinsèques des anticorps, telles que la séquence primaire, la structure tertiaire, l'hydrophobie non symétrique et les distributions de charge. (Liu et al., 2005 Roberts, 2007 Nishi et al., 2010). Par conséquent, la contribution potentielle des agrégats d'anticorps non liés aux événements CFSE – Antibody + a été testée. La plupart des événements CFSE – CD9 + ne correspondaient pas à des anticorps non liés et ont été réduits par la purification des véhicules électriques (Figure supplémentaire S5). Ces résultats suggèrent que les événements CFSE – observés dans l'analyse de population CD9 + correspondent à des particules non vésiculaires de composition moléculaire spécifique avec une taille similaire à celle des véhicules électriques. Des études futures, y compris une analyse détaillée de la morphologie et de la composition, seront nécessaires pour mieux définir ces particules non vésiculaires CFSE –.

Comparaison des méthodes de purification des véhicules électriques par FC

In spite of being considered a high-recovery and low-specificity method (Théry et al., 2019), isolation based on precipitation polymers such as ExoQuick ® resulted in a high proportion of CFSE + EVs. This agrees with studies suggesting that EVs prepared by ultracentrifugation or precipitation polymers are comparable (Helwa et al., 2017 Prendergast et al., 2018). In samples prepared by ExoQuick ® , however, we found that the proportion of CD9 + CFSE + events was reduced when compared to NP and other isolation methods. This suggests that, despite providing a high yield of EVs, ExoQuick ® may insert EV population bias. Also of concern, precipitating agents have previously been linked to potential loss of biological activity (Paolini et al., 2016) and structure (Gamez-Valero et al., 2016) of EVs. Thus, our data adds yet another parameter that should be carefully considered before selecting ExoQuick ® as a method of choice for the isolation of EVs.

SEC is the technique of choice for many groups interested in studying the composition and biological activity of vesicles, as it allows simple, fast and affordable isolation of EVs. As SEC is a key component of our FC strategy, the proportion of CFSE + particles in our preparations was measured to access the isolation efficacy of EVs by SEC. In our experimental settings, this preparation is referred to as NP (non-purified), since SEC is used after staining, and not before as a traditional isolation method. Although considered a low recovery, high specificity method (Théry et al., 2019), conditioned medium processed by SEC contained less than 40% of CFSE + vesicular particles. This was also the case for more complex samples, such as plasma and vitreous humor, in which the percentage of CFSE + particles after SEC processing were, respectively, �% and �%. These findings agree with recent studies using comparative transmission electron microscopy, in which SEC-derived preparations displayed a lower proportion of structures resembling EVs when compared to samples derived from differential ultracentrifugation (Takov et al., 2019).

Differential ultracentrifugation is one of the most commonly used EV purification methods. To improve EV purity, most researchers combine ultracentrifugation with additional techniques following the primary step, such as the use of washing steps with saline as well as the use of density gradients (Thery et al., 2018). We found that the proportion of CFSE + events and CD9 + events within the CFSE + gate did not differ in the absence (UC-III) or presence (UC-II and UC-IV) of washing steps with PBS or when a sucrose cushion step was used (UC-I). Our results suggest that these additional steps have no major impact in sample purity. However, a more detailed characterization of the potential impact of these washing and/or separation steps in the selection of populations of EVs with specific composition (protein, sugar, lipid, and nucleic acids) will be necessary in future studies.

Our FC strategy allows for faster processing times and also substantially decreases the sample volume requirements compared to conventional EVs isolation protocols (Table 1). Thus, we consider ours to be a consistent approach to be applied to control the quality of preparations of EVs.

While we used CFSE as a general EV marker, our experimental setup was performed having CD9 not only as an illustration of the capabilities of the method, but also as an analyte of interest. Our side-by-side comparison of CFSE + CD9 + events in samples submitted (UC-I) or not (NP) to isolation by ultracentrifugation showed that both strategies are comparable when analyzing CD9 + EVs populations (Figures 4C,D). However, although this equivalence was true for CD9 + EVs, we cannot discard the possibility that other populations of EVs behave differently, specially while probably there is no validated universal EV marker that can be used as an experimental control. Every method, including differential ultracentrifugation, potentially inserts population isolation bias to EVs (as illustrated in Figure 3C). Such isolation bias, if existent, has yet to be studied and understood. Be it for future studies in the field of population of EVs, or be it for studies involving other vesicular molecules, we believe and strongly suggest that side-by-side validation of non-purified versus purified samples (as in Figures 4C,D) should be performed as a pre-validation of our approach. Thus, for every EV molecule of interest, the approach presented in our work that relies on the use of NP samples in different contexts should first be validated by a comparison study similar to the one presented in Figures 4C,D.

Longitudinal Study of EVs in Plasma by FC

Longitudinal composition analyses can provide precious temporal information on the dynamics of EVs in physiological and pathological settings (Eitan et al., 2017 Menon et al., 2018 Wu et al., 2018). However, these studies are often difficult in microvolumes of samples, mainly due to the limited number of EVs that can be harvested in these experimental conditions (Théry et al., 2019). This constraint frequently leads to insufficient recovery of EVs (Clayton et al., 2018), unless small volume samples are pooled from multiple individuals or collections. Moreover, in studies involving small animals, the requirement for lethal bleeding in order to collect enough plasma for the effective isolation of EVs complicates the performance of longitudinal studies and increases the demand for animals, leading to higher costs, higher sample processing complexity and potential bioethical issues. By not requiring isolation of EVs prior to staining, our FC strategy allows for the analysis of both intra- and inter-individual heterogeneity in the population of interest throughout an experiment. In our studies, the proportion of CFSE + EVs and of CD9 + events within CFSE + EVs increased in the plasma of mice bearing liver metastatic pancreatic cancer lesions. Based on these results, we are currently studying the potential use of these readouts for follow-up studies of pancreatic cancer patients in the metastatic phase.

Study of EVs in Vitreous Humor by FC

The vitreous humor is a small-volume biofluid that contains low protein content, ranging from 120 to 500 ng/μL (Chowdhury et al., 2010), which is frequently considered to arise from filtration of plasma through fenestrated capillaries of the ciliary body stroma via the iris root (Freddo et al., 1990). Besides the quantitative differences in protein content, a comparison of vitreous humor and plasma proteome revealed that only 58% of the vitreous humor proteins have also been identified in human plasma (Chowdhury et al., 2010). Consistent with this, our analysis revealed that vitreous fluid contains three times more CFSE + vesicular structures when compared to plasma. Furthermore, it contained insignificant levels of CD9 + events, comparable to those found in control solutions with only CFSE and anti-CD9. These results are consistent with the previously reported absence of CD9 in EVs from vitreous humor (Murthy et al., 2014 Skeie et al., 2015 Zhao et al., 2018). However, it is still unknown whether the absence of CD9 + vesicles is a result of the filtration that occurs during the production of vitreous humor, uptake and degradation of this vesicle population by ocular cells, higher prevalence of non-endosomal EVs and/or other mechanisms. Although it is unclear to which extend ocular cells contribute to the collection of EVs found in vitreous humor, our FC strategy can be potentially used to study these vesicles both in pre-clinical and clinical settings as potential biomarkers and biological mediators of eye diseases.


Remarques finales

In conclusion, as you continue to optimize your flow cytometry experiments, take some time to focus on the blocking of the cells to minimize FcR mediated binding. This can be done with inexpensive human IgG serum quite easily. You can add the blocking reagent, incubate the cells for some period of time before adding the labeling reagents, and don’t have to do an extra wash, just some recalculating of the volumes.

More importantly, if you encounter some unusual staining patterns, the cause may be worth exploring. It could be the cells binding the fluorochrome, or it could be an antibody binding a fluorochrome- as shown in the PD-L1 example. Fortunately, there is a simple workaround to this, and that’s to add a second blocking reagent to minimize this effect.

It is important in the optimization phase to be extremely critical of any issues or differences you see, as you don’t want to carry something through to your production panel that could have been addressed in the optimization. Blocking is a necessary step, but often overlooked and based on lab tradition. Armed with this new knowledge, go forth and block better.

To learn more about important control measures for your flow cytometry lab, and to get access to all of our advanced materials including 20 training videos, presentations, workbooks, and private group membership, get on the Flow Cytometry Mastery Class wait list.

Tim Bushnell holds a PhD in Biology from the Rensselaer Polytechnic Institute. He is a co-founder of—and didactic mind behind—ExCyte, the world’s leading flow cytometry training company, which organization boasts a veritable library of in-the-lab resources on sequencing, microscopy, and related topics in the life sciences.


1. INTRODUCTION

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the accumulation of malignant B cells. The disease generally affects elderly people and shows an indolent clinical course. 1 Despite encouraging therapeutic advances, CLL still is considered an incurable disease. 2 A number of prognostic markers such as IGHV mutational status, expression of ZAP-70, CD38, and β2-microglobulin as well as certain cytogenetic abnormalities (e.g., del17p) have been described. 3 More recent studies have presented a new prognostic score (CLL-IPI) and novel genetic markers (e.g., NOTCH1 and TP53 mutations). 4, 5

While immunochemotherapy has been the standard first-line treatment of CLL for many years, novel therapies targeting B cell receptor (BCR) signaling such as ibrutinib and idelalisib play an increasingly important role. 6 Along these lines, several recent studies have focused on altered signal transduction through the BCR and consecutively impaired calcium flux in CLL. Le Roy et al. demonstrated that in vitro stimulation of the BCR results in calcium flux and nuclear factor of activated T cells (NFAT) activation and could show that DNA binding capacity of NFAT2 correlates with clinical outcome. 7 Another study has recently demonstrated that surface IgM expression and intracellular calcium mobilization are dependent on IGHV mutational status and DNA methylation. 8 Multiple laboratories have furthermore characterized anergy, a state of BCR unresponsiveness and impaired calcium mobilization, as a hallmark of indolent CLL with favorable outcome. 9, 10 Previous studies have primarily analyzed calcium mobilization in PBMCs without gating for CLL cells or required a time-consuming isolation of CLL cells before the measurements. Furthermore, ratiometrics with FuraRed by calculation of the ratio between bound and unbound calcium has been established for PBMCs 11 and provides several advantages, although has not been used in the context of CLL. 12

In the current study, we have established a flow cytometry-based assay to evaluate intracellular calcium flux capabilities in primary CLL cells employing a cohort of 25 patients. The degree of calcium flux was subsequently correlated with well-established prognostic parameters and clinical outcome. Using a receiver operating characteristics (ROC) analysis, we defined a cutoff value to discriminate a responder from a nonresponder population with significant differences in progression-free survival (PFS). In summary, we provide a novel assay to quickly and reliably assess BCR signaling in CLL cells as a means to predict clinical outcome.


Flow Cytometry: Going with the Flow

Sara Bowen, PhD, is a biochemist with what can only be described as a giddy excitement for her job. She runs the flow cytometry facility at St. Joseph’s Hospital and Barrow Neurological Institute in Arizona, and she positively lights up when talking about “flow” and her lasers.

Dr. Sara Bowen. Photo by Cathy Seiler.

An analogy to understand flow cytometry is to think about a stream filled with lots of different fish: big fish and small fish, black fish and white fish. To better understand the characteristics of the fish in the stream, you could direct each fish into a small channel in the stream where they can pass through in single file. From looking at them one at a time, you can note if the fish is big or small or black or white. Flow cytometry is exactement comme ça. Instead of fish, Sara is looking at hundreds of thousands of cells. Instead of a stream and a small channel, she is using a flow cytometry machine. And instead of her eyes and a notebook, she’s using lasers and flow cytometry software. And yes, her job really is that cool.

We had a chance to talk with Sara about being a scientist, how she got interested in flow cytometry, why flow is so important, and why she’s so obsessed with lasers.

Cathy Seiler: You have your PhD in biochemistry, but not all biochemists do the same thing. What does being a biochemist mean to you?

Dr. Sara Bowen: When I think of biochemists, I sort us into two main buckets. Some are trying to understand parts of a picture. They are looking at a very specific piece of biology and trying to figure out how it does what it does. For example: How does the shape of a hemoglobin protein affect its ability to hold on to and release oxygen? Biochemists in the other bucket are asking questions about the picture as a whole. They want to know how the parts fit together to make biological processes work. For example, what hormones are released when you eat a tangelo, and how do they help you digest it? But zoomed in or zoomed out, all biochemists are trying to understand how biology works, be it human, penguin, jellyfish, or tulip tree biology.

Seiler: How did you first become interested in flow cytometry?

Flow cytometry image of blood cells detecting two different markers (CD3 and CD19) that light up different colors using different color lasers. This experiment separated different types of blood cells called T cells and B cells. Credit: Sara Bowen.

Bowen: Ever had to give a book report? Well, that doesn’t stop when you get to graduate school. I had to read a scientific paper about flow cytometry and explain it to my classmates, and at the time, I had never even heard of flow. When I was getting started, all I could think about was that the data looked like someone had sneezed on a page. How does anybody make sense of all those dots?! But in the process of learning about flow well enough to explain it to my classmates, I realized that it is a powerful tool for scientists. And when it hit me that the whole thing is possible because of all the colors in the rainbow, I was in love.

Seiler: What is with your obsession with lasers?

Bowen: Did I mention that I like colors? Each of my lasers is a specific color: violet, blue, or red. The cells (or molecules that are attached to the cells) that I’m looking at interact with different colors of light differently depending on the cells’ or molecules’ physical properties. That sounds complicated, so think of it this way. Your boss comes in and says, “What is going on in here?” Depending on the tone of voice, you will probably react differently. If your boss sounds angry, you might react defensively. If your boss is laughing, you might laugh back. If your boss is clearly talking to himself as he or she wanders by, you might not react at all. A big part of my job is figuring out how to combine laser color and cells or molecules so that I can gauge the “reactions” of the cells or molecules in a way that I can understand. My job is a game, and lasers make it possible to play.

[Cathy’s note: If you think of the fish analogy above, the lasers are what detect the color of the fish in the stream.]

Also, just say out loud: “I work with lasers.” Sounds impressive, right?

Seiler: How can flow cytometry and your work help people?

Bowen: I think a good way to start answering this question is by listing some of the things flow cytometry has already done for people:

  • It was crucial for understanding and diagnosing HIV/AIDS.
  • It was instrumental during the Human Genome Program.
  • It has been critical in understanding, diagnosing, and treating leukemia and lymphoma.

All three of those contributions are massively important to humankind. In my work, I’m helping other scientists use flow to combat serious health issues including stroke, Multiple Sclerosis, brain cancer, and transplant rejection.

Seiler: What is one thing you really want readers to know about you, flow cytometry, or science in general?

Bowen: Scientists are just regular people. Most of us aren’t particularly brilliant, but we sommes persistent. We’re all trying to understand things that have never been explained before. We do that by building on what’s already known and testing all the possibilities that force add knowledge. That means most days science is more tedious than exciting.

Seiler: What advice would you give to someone who is interested in pursuing a career like yours?

Bowen: Be persistent. Sometimes (or a lot of times) you will fail, and that’s OK. It might feel like you are the only one struggling, but I promise you’re not.

-Dr. Cathy Seiler is the manager of the Biobank Core Facility at Barrow Neurological Institute and St. Joseph’s Hospital. She received her bachelor’s degree in biochemistry and molecular biology at Boston University and her PhD at the Watson School of Biological Sciences at Cold Spring Harbor Laboratory, studying cancer. In her spare time, Cathy is the editor for ISBER News and writes about science and the life of a scientist on her blog Things I Tell My Mom .


Voir la vidéo: 1 préparation à la cytométrie en flux (Août 2022).